抗體純化中的常見問題

1、優(yōu)質(zhì)的抗體包含的條件：
⑴抗體的純度大于95%（這里的純度是指有效抗體的含量而不是單純的電泳純度）；
⑵抗體的活性（效價(jià)高）；
⑶抗體的穩(wěn)定性（4保存10天無沉淀，-20保存3年以上效價(jià)無明顯變化，反復(fù)凍融10次無沉淀）。
 
2、ProteinA/G純化的不利因素：
Protein A是一種金黃色葡萄球菌（Protein G是一種鏈球菌株）細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合（有時(shí)結(jié)合少許IgM），故此可以分離出IgG抗體。但是Protein A/G卻無法區(qū)分特異性IgG的Fc段還是非特異性IgG的Fc段，故此Protein A/G純化出的是總的IgG蛋白。
 
腹水中含有白蛋白、γ球蛋白、巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞及其殘片、脂肪、小鼠的各種雜蛋白（如游離的鼠IgG、IgM），而我們真正需要的抗體只占很少一部分（大約占15%左右）；而抗血清中的有效抗體也只占總IgG的30%左右，其余都是無關(guān)的IgG或無用的抗體；所以Protein A/G純化的抗體看似“很純”（電泳圖），其實(shí)真正有效的“目的抗體”單抗只占比75%左右，（兔）多抗只占比30%左右。
 
3、利用抗原親和純化抗體的優(yōu)缺點(diǎn)。
親和純化是抗體抗原的結(jié)合，理論上應(yīng)該是純度最高特異性最好的純化方法，但是通常由于抗原的提取難度非常困難，所以獲得高純度的抗原并不是一件非常簡單的事情。當(dāng)我們不能獲得高純度的抗原時(shí)親和層析做出來的抗體也就不會(huì)那么純了；另外親和純化時(shí)抗原抗體的結(jié)合比較牢固，要想分離抗原抗體就需要大幅降低洗脫液的pH值，抗體（蛋白）在這么低地pH下很容易變形失活，損傷是無法避免的。故此種情況下純化出的抗體穩(wěn)定性差，4保存1天就會(huì)出現(xiàn)少許沉淀，反復(fù)凍融很容易產(chǎn)生沉淀。
 
4、純化出的抗體效價(jià)低的原因。
效價(jià)低是因?yàn)樘禺愋钥贵w含量少；有沉淀是因?yàn)榭贵w純度不夠，雜蛋白含量高，如果是親和純化的抗體，那么可能是由于純化過程中，抗體受到了損傷，抗體的結(jié)構(gòu)和性能有所改變引起的。
 
5、為什么用Protein A/G純化的抗體電泳很純但做WB時(shí)卻并不理想？
聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質(zhì)純度的鑒定，聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷的物質(zhì)分離開，并且還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開。其分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般層析方法和電泳方法，且重復(fù)性好，沒有電滲作用。
 
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質(zhì)分子量。其原理是：帶大量電荷的SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上克服了蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響而得到恒定的荷/質(zhì)比。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質(zhì)分子量已經(jīng)比較成功，此法測定時(shí)間短，分辨率高，所需樣品量極少（1-100ug），但只適用于球形或基本上呈球形的蛋白質(zhì)，某些蛋白質(zhì)不易與SDS結(jié)合，如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此時(shí)測定結(jié)果就不準(zhǔn)確。
 
電泳只能根據(jù)分子量的大小進(jìn)行分離，無法區(qū)分蛋白的性質(zhì)，比如IgG的分子量都是150KD，通過電泳時(shí)無法區(qū)分哪些是自身的IgG，哪些是抗體的IgG。而Protein A/G純化出的是總的IgG蛋白，分子量都是150KD，故此通過電泳條帶都是一樣的，無法將雜IgG和目的抗體IgG分離出來。所以有時(shí)用Protein A/G純化的抗體，電泳很純但做WB時(shí)卻并不理想，這是純化方法和純化工藝的不當(dāng)引起的。
 
6、為什么抗體需要純化？
腹水或血清含有大量的雜蛋白和多種抗體，真正需要的抗體正常情況下只占總蛋白的15%左右。未純化的抗體（或純化不好的抗體），不僅會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，而且還可能產(chǎn)生與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相反的結(jié)論。
 
抗體純化的好處：純化的抗體能降低非特異性本底，去除引起實(shí)驗(yàn)誤差的污染蛋白，另一方面能精確控制實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生陽性信號(hào)的抗體量，可以濃縮抗體。