鈣離子熒光探針類型大盤點

鈣離子在許多生理過程中起著復雜的作用。例如，細胞內(nèi)鈣離子在促進神經(jīng)元從神經(jīng)元中釋放神經(jīng)遞質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導途徑中必不可少，并參與所有肌肉細胞收縮所需的機制。細胞離子濃度受被動和主動離子通道和泵的調(diào)節(jié)。離子通道和泵的故障可能導致離子濃度調(diào)節(jié)不當，從而產(chǎn)生不利于正常細胞功能的不利條件。

鈣離子濃度研究領(lǐng)域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結(jié)合來觀察細胞內(nèi)鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結(jié)合Ca2+前幾乎無熒光，結(jié)合Ca2+后，熒光強度顯著增強，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)、熒光光譜法以及熒光酶標儀等多種方法檢測。

 常用的Ca2+熒光探針根據(jù)波長的不同，分為兩大類：

1. 可見光激發(fā)Ca2+熒光探針

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有以下特點：

a.適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

b.具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca2+變化，從而降低了對活細胞的光毒性。

c.Ca2+依賴性熒光強度增強，對Ca2+變化水平檢測敏感度更高。

d.降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

e.兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。

f.無光譜偏移。

最受歡迎的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針，較高的Ca2+結(jié)合力可捕捉細胞內(nèi)Ca2+信號的動力學變化，使用于多種流式細胞術(shù)相關(guān)實驗，如籠鎖Ca2+螯合劑光活化、第二信使、神經(jīng)傳導物質(zhì)研究以及細胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是，當它與細胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強的熒光，熒光會增加60至100倍，最大激發(fā)波長為 506nm，最大發(fā)射波長為 526nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

2）Fluo-4

Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結(jié)構(gòu)上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一種可見光激發(fā)的高親和力Ca2+指示劑，與其他可見光激發(fā)熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現(xiàn)象的細胞和組織內(nèi)鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導致的鈣離子釋放。

為什么許多熒光探針會有R-AM或者鉀鹽形式提供？

以Fluo-4和Fluo-4, AM為例：

常規(guī)的熒光探針如Fluo-4是極性大的酸性化合物，無法進入細胞內(nèi)。此時，若想做細胞內(nèi)染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實現(xiàn)藥物加載，非常繁瑣。為此，而通過在Fluo-4的負性基團上結(jié)合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負電荷，極大的提高了細胞滲透性。只需要把細胞孵育在含藥物的培養(yǎng)液中，即可實現(xiàn)加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進入細胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復Fluo-4，在胞內(nèi)完全發(fā)揮其正常生理功能。

2. 紫外光激發(fā)Ca2+熒光探針

Fura-2和Indo-1均屬紫外激發(fā)Ca2+熒光指示劑，也是目前最常用的鈣比率測量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，F(xiàn)ura-2和Indo-1發(fā)出更強的熒光，在生理pH范圍內(nèi)對pH變化不敏感。與Mg2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等二價金屬離子相比，對Ca2+有更高的選擇性，因此得到了廣泛應用，同時作為雙波長熒光染料在標定Ca2+濃度時不再單純依靠熒光強度的變化。

Fura-2是雙激發(fā)波長熒光染料，Indo-1是雙發(fā)射波長熒光染料，均采用比率測量方法，該方法可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數(shù)字成像顯微鏡，使用該設(shè)備可更方便的調(diào)整激發(fā)波長，使探針結(jié)合鈣離子后在300-400nm的激發(fā)波長范圍內(nèi)掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測發(fā)射波長。相比之下，Indo-1更傾向于流式細胞術(shù)檢測，使用該設(shè)備可實現(xiàn)在氬離子激光器的351-364光譜范圍內(nèi)單一波長的激發(fā)，在400nm和480nm的波長處分別檢測結(jié)合鈣離子和未結(jié)合鈣離子的熒光信號，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細膜滲透性。

1）.腔腸素鈣離子熒光探針：

腔腸素（Coelenterazine native），又稱腔腸素游離酸，是海腎熒光素酶（Rluc）和Gaussia熒光素酶（Gluc）等多種熒光素酶的作用底物，也是水母發(fā)光蛋白的輔助因子，應用非常廣泛，可用于檢測活細胞中鈣離子濃度.

水母發(fā)光蛋白復合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔腸素組成。只有當鈣離子（Ca2+）與該復合物結(jié)合后，腔腸素才能被氧化生成高能量產(chǎn)物Coelenteramide，同時釋放出CO2和藍色熒光（~466 nm）。正是此Ca2+依賴性的反應過程（見圖1），使得腔腸素非常適用于監(jiān)測活細胞內(nèi)鈣離子水平。

與常規(guī)的熒光鈣離子指示劑相比，其主要具有以下幾個優(yōu)點:

a.能檢測較大范圍的鈣濃度 – 從0.1 μM至 >100μM；

b.樣品無自體熒光，背景熒光低于使用熒光鈣離子指示劑；雖然信號比使用熒光鈣離子指示劑弱，但是通過成像儀器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的靈敏度。

c.水母發(fā)光蛋白復合體能夠穩(wěn)定維持在細胞內(nèi)，使其能夠進行數(shù)小時至數(shù)天的鈣離子監(jiān)測。

鈣離子熒光探針Cal-500 , 鉀鹽是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的鈣離子熒光探針，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供最強大的均勻熒光測定工具，用于檢測細胞內(nèi)鈣動員。與現(xiàn)有的鈣指示劑（如Fluo-3 AM，F(xiàn)luo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，這些鈣敏感染料明顯更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了細胞內(nèi)保留和負載效率。表達通過鈣發(fā)出信號的GPCR或鈣通道的細胞可以預裝載可以穿過細胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦進入細胞內(nèi)，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的親脂性阻斷AM基團被細胞內(nèi)酯酶切割，產(chǎn)生帶負電荷的熒光Calbryte 染料，留在細胞內(nèi).

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