冷凍電鏡樣本制備新技術(shù)在新冠病毒結(jié)構(gòu)解析的應(yīng)用
前言
近日，由新型冠狀病毒引起的肺炎疾病在武漢和全國各地都形成了一定規(guī)模的爆發(fā)，已經(jīng)引起了中國甚至全球的高度重視，那么這個冠狀病毒究竟是什么？
冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬冠狀病毒科(Coronaviridae)，是具外套膜(envelope) 的正鏈單股RNA病毒，直徑約80～120nm。冠狀病毒可以引起中東呼吸綜合征、嚴(yán)重急性呼吸綜合征以及目前正在爆發(fā)的新型肺炎。近日，國家病原微生物資源庫發(fā)布了由中國疾控制中心病毒預(yù)防控制所成功分離的我國第一株病毒的電鏡照片。
下圖中（電子顯微鏡下的新型冠狀病毒武漢株01），黑色箭頭所示就是新型冠狀病毒，可以看出，病毒的大小約為100納米。
解析冠狀病毒結(jié)構(gòu)，助力疫苗和藥物研發(fā)
目前，我們已知新型冠狀病毒是RNA病毒，它的蛋白結(jié)構(gòu)序列還沒有確定出來，在分離完毒株之后，則要用冷凍電鏡來全面解析病毒的三維結(jié)構(gòu)，從而為開發(fā)疫苗和相關(guān)的藥物奠定基礎(chǔ)。2019年，中國科學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)解析到世界上目前分辨率最高的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)，這對我們了解該病毒的發(fā)病機(jī)理，以及如何更好地開發(fā)疫苗至關(guān)重要。在這個特殊的時(shí)期，盡快加速新冠病毒的結(jié)構(gòu)解析同樣意義重大，有助于研發(fā)出更多更好的抗新型肺炎藥物。
我國科學(xué)家解析出的非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)示意圖
最近，上�？萍即髮W(xué)和中科院上海藥物所聯(lián)合團(tuán)隊(duì)預(yù)先公布抗冠狀病毒最關(guān)鍵的蛋白之一，3CL水解酶的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，并已迅速發(fā)現(xiàn)了30種可能對新型冠狀病毒有治療作用的藥物、活性天然產(chǎn)物和中藥。在這個過程中，冷凍電鏡技術(shù)是獲得高分辨率的冠狀病毒三維結(jié)構(gòu)的最佳手段。那么，冷凍電鏡是何物？
冷凍電鏡技術(shù)： 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的革命性突破
冷凍電鏡技術(shù)（Cryo-EM）的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜，然后利用快速冷凍技術(shù)如置于液態(tài)乙烷使其形成玻璃態(tài)的冰，生物大分子就被固定在這層薄冰里。將這樣的冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子原子分辨率的三維空間結(jié)構(gòu)，被稱為冷凍電鏡技術(shù)。冷凍電鏡的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)方法如X射線晶體衍射和核磁共振的技術(shù)局限，使得解析高分辨率生物大分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)變得更為容易和常規(guī)。
英國劍橋MRC實(shí)驗(yàn)室人員在操作冷凍電鏡
近年來，越來越多蛋白質(zhì)或復(fù)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析領(lǐng)域被稱為諾貝爾獎級別的論文陸續(xù)發(fā)表，背后的利器正是冷凍電鏡。2015年，《自然》雜質(zhì)旗下的子刊nature method將冷凍電鏡技術(shù)評為年度最受關(guān)注技術(shù)。在過去幾年里，冷凍電子顯微鏡技術(shù)逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究工具。冷凍電鏡技術(shù)的三位先驅(qū)者，也憑借對冷凍電鏡技術(shù)的開拓和持續(xù)推進(jìn)，獲得了2017年的諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他們在冷凍電子顯微鏡技術(shù)上的杰出貢獻(xiàn)，使電子顯微鏡在高真空環(huán)境下觀察接近生理狀態(tài)下的蛋白成為可能。
2017 年諾貝爾化學(xué)獎三位獲獎?wù)?/strong>
冷凍電鏡關(guān)鍵步驟：樣本制備
冷凍電鏡技術(shù)關(guān)鍵步驟是制備高質(zhì)量的的樣本，即如何保證樣品分子顆粒均一的分布在厚度恰當(dāng)?shù)牟ＡB(tài)冰層中決定著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的成敗�，F(xiàn)有冷凍樣本的樣本制備流程如下：
把載有樣品如緩沖液中的病毒、蛋白質(zhì)和 DNA 組裝顆粒等的電鏡載網(wǎng)快速投入經(jīng)液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，在載網(wǎng)孔或支持膜上形成約十幾到過百納米的玻璃態(tài)薄冰， 樣品顆粒則被分散包埋在其中而形成冷凍樣品。薄層水玻璃化法簡單快速， 適用于單顆粒生物樣品的研究， 此制樣技術(shù)被廣泛用于病毒、大分子及其復(fù)合體的研究。
冷凍電鏡樣本制備流程示意圖
現(xiàn)有冷凍電鏡樣本制備技術(shù)的缺陷
然而，傳統(tǒng)冷凍電鏡樣本制備方法存在缺陷：
1. 以手工或半自動設(shè)備，操作復(fù)雜，依賴較高的技巧
2. 采用blot方式，大量樣品被浪費(fèi)在濾紙
3. 實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差
4. 樣品存放的可追溯性差，容易導(dǎo)致樣品丟失
總體而言，冷凍電鏡的樣品制備技術(shù)的不成熟已經(jīng)成為限制冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵性因素。為了解決這個核心問題，來自于英國SPT Labtech公司 (前身為TTP Labtech，其核心產(chǎn)品mosquito 在蛋白結(jié)晶篩選領(lǐng)域家喻戶曉) 最新研發(fā)了一款全自動冷凍電鏡樣本制備系統(tǒng): 變色龍(chameleon)，致力于解決目前樣本制備過程存在的上述種種問題。（變色龍：新一代冷凍電鏡全自動樣本制備系統(tǒng)）
變色龍 - 帶來冷凍電鏡樣本制備技術(shù)的革命性突破：全自動，blot free
變色龍?jiān)跇悠分苽渲杏幸韵绿厣?/span>
1. 整個過程全自動，包括grid的夾取，點(diǎn)樣，拍照等操作，無人為干預(yù)，確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。
2. Blot-free：告別使用濾紙blot的時(shí)代。變色龍采用獨(dú)特的self-wicking 碳膜銅網(wǎng)，通過內(nèi)部納米銅纖維的毛細(xì)作用，幫助樣品在短時(shí)間內(nèi)迅速形成薄膜層。
3. 樣品使用量低：通過分液探頭，可將樣品快速噴至grid銅網(wǎng)上，最低僅需6 nL。
4. 快速plunge time：從噴點(diǎn)樣品至銅網(wǎng)上到置于液態(tài)乙烷進(jìn)行快速冷凍，最快僅需54 毫秒，避免較長暴露在空氣中可能導(dǎo)致的樣品構(gòu)象排列的傾向性。
5. 借助獨(dú)有的圖像算法軟件，在正式電鏡實(shí)驗(yàn)前，提前獲得最優(yōu)化的冰層范圍以及相應(yīng)的plunge time。
6. 專門設(shè)計(jì)的成像和軟件系統(tǒng)，追溯每個參數(shù)和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。
結(jié)束語
國內(nèi)冷凍電鏡應(yīng)用領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物，中國科學(xué)院院士、結(jié)構(gòu)生物學(xué)家、西湖大學(xué)校長施一公曾表示，冷凍電鏡的發(fā)展像是一場猛烈的革命。“就目前發(fā)展前景來看，冷凍電鏡技術(shù)是可與測序技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)相提并論的第三大技術(shù)！” 冷凍電鏡技術(shù)的突破給結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域帶來了一場大風(fēng)暴，大量高分辨率的分子機(jī)器、膜蛋白、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)被報(bào)道，相關(guān)領(lǐng)域的研究也邁進(jìn)了一個嶄新的時(shí)代。
作為冷凍電鏡關(guān)鍵的前序步驟: 樣本制備，新一代冷凍電鏡全自動樣本制備系統(tǒng)“變色龍”的出現(xiàn)，致力于改變現(xiàn)有傳統(tǒng)技術(shù)的種種缺陷，以期幫助科學(xué)家更加穩(wěn)定、高效地獲得高質(zhì)量的冷凍電鏡樣本。
