微縮化技術(shù)在宏基因組測(cè)序建庫中的應(yīng)用

2020年伊始，突如其來的新冠疫情牽動(dòng)著每個(gè)人的心。自武漢衛(wèi)健委首發(fā)肺炎疫情情況通報(bào)后的短短一個(gè)星期，新型冠狀病毒就在實(shí)驗(yàn)室中被檢出，并獲得了該病毒的全基因組序列。如此快速地確定病原體搶占研究先機(jī)，宏基因組測(cè)序技術(shù)功不可沒。
 

宏基因組學(xué)(Metagenomics)，以環(huán)境樣品中的微生物群體為研究對(duì)象，無需純化培養(yǎng)，能夠直接研究自然狀態(tài)下的微生物群落。通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，利用基因組學(xué)的研究策略可以快速獲得微生物基因序列、多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性等信息。

圖片來源：Fields, Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224
 

隨著基因測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于二代測(cè)序的宏基因組學(xué)能夠幫助研究人員快速準(zhǔn)確的得到大量微生物基因組數(shù)據(jù)和信息，宏基因組學(xué)研究已從分析少量樣品迅速發(fā)展為對(duì)大規(guī)模樣品的分析。那么隨之而來的，可能就是經(jīng)費(fèi)的限制問題了。很多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)體系微縮化的方法，來節(jié)約試劑和input成本。來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員，使用SPT Labtech的自動(dòng)化液體處理平臺(tái)mosquito進(jìn)行宏基因組測(cè)序文庫構(gòu)建，在KAPA HyperPlus試劑盒標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系縮小了1/10的條件下，依然可以得到高質(zhì)量的組裝結(jié)果。對(duì)于多樣性較高的宏基因組樣本，依然保證了其基因組的復(fù)雜性。

10倍微縮化Kapa HyperPlus文庫構(gòu)建策略
 

微生物高通量測(cè)序：mosquito genomics“微”你而來

 在微生物高通量測(cè)序領(lǐng)域，對(duì)于一些珍貴的微生物含量稀少的樣本，如何精準(zhǔn)移液一直是科學(xué)家們想要解決的問題，現(xiàn)在小于0.5μL的移液量，普通移液槍已經(jīng)很難完成精確操作了。SPT Labtech公司（前身為TTP Labtech）的mosquito是全球最受歡迎的納升級(jí)移液工作站之一，它擁有獨(dú)有的固相置換技術(shù)，可以無視任何黏度的試劑或DNA，可對(duì)500nL-5μL (HV設(shè)備)或25nL to 1.2μL (LV設(shè)備)樣品進(jìn)行精確加樣。

     

在微生物擴(kuò)增子測(cè)序及宏基因組測(cè)序中，使用mosquito進(jìn)行文庫構(gòu)建可以節(jié)省大約1/10的建庫試劑成本。不論是源板還是槍頭的死體積極低，不會(huì)造成試劑額外的浪費(fèi)，一次性槍頭自動(dòng)替換，有效避免樣本的交叉污染，靈活、準(zhǔn)確、高效的特性使它成為眾多微生物基因組學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室所鐘愛的設(shè)備。

1、馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物組服務(wù)實(shí)驗(yàn)室是如何實(shí)現(xiàn)降低16S 測(cè)序試劑成本并提高產(chǎn)量的?

     mosquito的使用非常靈活，能與多種自動(dòng)化設(shè)備進(jìn)行整合。在馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因組學(xué)研究所微生物組學(xué)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室的NGS實(shí)驗(yàn)流程中，通過整合mosquito以及其他大型高通量設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)流程的自動(dòng)化。

微生物擴(kuò)增子測(cè)序文庫構(gòu)建微縮化流程

       “我們中心的核心工作就是做微生物測(cè)序，處理各種各樣與疾病或者環(huán)境有關(guān)的微生物樣本， mosquito和我們實(shí)驗(yàn)流程很好的整合在一起，我們用它來進(jìn)行文庫制備，降低了樣本用量，儀器不論是軟件編程，還是使用起來都非常方便，以前我們?cè)谧鰷y(cè)序的時(shí)候會(huì)浪費(fèi)比較多的試劑，mosquito給我們帶來的好處是，我們能用更少的材料去做實(shí)驗(yàn)，就可以拿到我們需要的結(jié)果，它速度很快，幾分鐘就能完成一快板，又快又省經(jīng)費(fèi)。”

——Mike Humphrys 馬里蘭大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室主任

2、mosquito助力Cell雜志重磅研究：腸道菌群或是自閉癥發(fā)病與治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)！

      來自加州理工學(xué)院的研究人員在Cell雜志上發(fā)表了題為Human Gut Microbiota from Autism Spectrum Disorder Promote Behavioral Symptoms in Mice的論文。發(fā)現(xiàn)腸道菌群可通過生成具有神經(jīng)活性的代謝產(chǎn)物而調(diào)控小鼠的行為，本研究選取自閉癥患者和正常個(gè)體的腸道菌群移植入無菌小鼠腸道中，對(duì)本體及其后代小鼠的行為學(xué)特征及組織樣本進(jìn)行分析。攜帶有自閉癥患者腸道菌群的小鼠(ASD小鼠)表現(xiàn)出明顯的類自閉癥癥狀。

      為鑒別影響小鼠自閉癥行為的關(guān)鍵菌種，研究者對(duì)自閉癥患者的腸道菌群、移植小鼠及其后代的腸道菌群類別進(jìn)行了系統(tǒng)分析，該研究中，使用mosquito進(jìn)行了10倍微縮化的宏基因測(cè)序文庫構(gòu)建工作。研究發(fā)現(xiàn)自閉癥患者及ASD小鼠的腸道菌群與對(duì)照組有明顯差異。其中，正常個(gè)體/小鼠中卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)和糞副擬桿菌(Parabacteroides merdae)有明顯富集；而自閉癥個(gè)體/小鼠中毛螺菌科的菌種(Lachnospiraceae)則明顯多于對(duì)照組。提示了特定類型的腸道菌群或是引起自閉癥相關(guān)癥狀的重要環(huán)節(jié)。

腸道菌群移植小鼠模型中有明顯差異的菌種

3、病原微生物檢測(cè)：mosquito搞定18倍微縮化NGS文庫定量！

   
  在Microbiome雜志發(fā)表的一項(xiàng)名為Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue的研究中，來自劍橋大學(xué)的研究人員對(duì)先兆子癇妊娠結(jié)局不良人群（n  = 199）和健康對(duì)照人群（n  = 99）的胎盤細(xì)胞進(jìn)行改進(jìn)的18S擴(kuò)增子測(cè)序，使其能夠在超過70,000個(gè)人細(xì)胞中檢測(cè)到惡性瘧原蟲，釀酒酵母或弓形蟲的等病原微生物單個(gè)基因組拷貝。其中使用了mosquito對(duì)18S擴(kuò)增子文庫進(jìn)行質(zhì)檢，并把Biotium AccuClear dsDNA quantitation試劑盒體系縮小了18倍。使用這種方法，研究院人員無法在胎盤活檢中檢測(cè)到真核病原體生物。說明胎盤的真核感染不是上述妊娠并發(fā)癥的根本原因。這種病原微生物的檢測(cè)方法也為感染性疾病的臨床診斷提供了方法參考。

結(jié)束語
 

      就在近日，宏基因組測(cè)序再度在疾病研究中發(fā)揮作用。3月4日，北京地壇醫(yī)院對(duì)新冠肺炎患者采集的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行宏基因組二代測(cè)序、鑒定可能的感染病原體過程中，獲得了SARS-CoV-2病毒基因組序列，首次證實(shí)病毒攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病例。
 

     宏基因組測(cè)序是微生物領(lǐng)域研究的強(qiáng)有力工具。mosquito用無與倫比的性能和通用性，為基因組學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室提供低成本、高效率的NGS建庫方案。

參考文獻(xiàn)：

Sanders, J. G. et al. Optimizing sequencing protocols for leaderboard metagenomics by combining long and short reads. Genome Biol. 20, 1–14 (2019)

Sharon, G.; Cruz, N.J.; Kang, D.W.; et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell 2019, 177, 1600–1618.

Susanne, Lager, Marcus, et al. Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue.[J]. Microbiome, 2018.