案例解析 | 抗病毒生物大分子制藥治療

近期爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19，對(duì)應(yīng)的病毒為SARS-CoV-2）突出了開(kāi)發(fā)有效治療方法的重要性。在近期的公眾號(hào)中，我們向大家介紹了“人民的希望”瑞德西韋的工作機(jī)制[1]，在此，我們結(jié)合疫苗、血清、多肽和單抗的研究案例，向大家繼續(xù)介紹靶向病毒的大分子治療和我們的解決方案是如何推動(dòng)下一代治療研究的。

 

No.1針對(duì)MERS的疫苗優(yōu)化研究

 

中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，是近年來(lái)第二個(gè)造成大規(guī)模人群傳染的冠狀病毒，相較于SARS病毒，其致死率高、發(fā)病快，因此急需研發(fā)有效的疫苗用于被動(dòng)免疫。在2015年由NIH的Barney S. Graham主導(dǎo)的研究中，科學(xué)家評(píng)價(jià)和比較了靶向MERS的多種疫苗方案[2]。

 

基于DNA和蛋白為免疫原的免疫流程，圖片源自參考資料2。

 

圍繞MERS冠狀病毒的刺突蛋白(S)，研究構(gòu)建了多種cDNA和蛋白免疫原，分別通過(guò)電轉(zhuǎn)和配合佐劑的形式免疫小鼠。為了提升研究的安全性，科學(xué)家建立了帶有化學(xué)發(fā)光報(bào)告基因的假病毒體系。通過(guò)檢測(cè)由病毒感染所致的化學(xué)發(fā)光，研究利用可溶性DPP4（MERS 靶點(diǎn)）和DPP4抗體驗(yàn)證了假病毒的功能。

 

MERS假病毒功能性驗(yàn)證，左圖：基于過(guò)表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證DPP4過(guò)表達(dá)提升病毒的感染能力，Huh7.5內(nèi)源性高表達(dá)DPP4。中圖：基于可溶性DPP4的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。右圖：利用DPP4抗體抑制假病毒的感染。假病毒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺(tái)。圖片源自參考資料2。

 

借助假病毒體系，研究追蹤和評(píng)價(jià)了不同免疫策略產(chǎn)生的血清的中和能力和針對(duì)多種MERS病毒株的交叉中和能力。從結(jié)果可以看出，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案所獲得的抗體最為有效，且能中和多種MERS病毒株。通過(guò)進(jìn)一步的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和血清吸附實(shí)驗(yàn)，研究證實(shí)不同的免疫流程得到的血清靶向的S蛋白位置也不一樣。與經(jīng)典的微量中和實(shí)驗(yàn)(Microneutralization)相比，研究證實(shí)假病毒體系評(píng)價(jià)抗體中和能力更為敏感，靈敏度約有一個(gè)數(shù)量級(jí)的提升。通過(guò)解析抗體的亞型，研究發(fā)現(xiàn)基于S DNA的免疫方案能誘導(dǎo)IgG2a為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而S1蛋白刺激則產(chǎn)生IgG1為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在小鼠中，IgG2a的出現(xiàn)反映了Th1型免疫反應(yīng)，促進(jìn)了抗病毒相關(guān)因子如interferon-γ的釋放，提升了T細(xì)胞介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。因此，相較于蛋白，基于DNA的疫苗可以通過(guò)建立T輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)更有效的控制病毒感染。

 

血清的交叉中和能力檢測(cè)。假病毒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺(tái)。圖片源自參考資料2。

 

對(duì)應(yīng)的，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（印度恒河猴）模型上，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案產(chǎn)生的中和抗體滴度優(yōu)越于基于全程DNA的免疫方案。病毒接種后，相較于對(duì)照組，免疫組動(dòng)物顯著降低肺部病理指標(biāo)。疫苗中DNA免疫原的引入更是進(jìn)一步緩解肺部的損傷情況，并加速了康復(fù)過(guò)程。

 

基于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（印度恒河猴）模型的疫苗評(píng)價(jià)。上圖：免疫流程。下左圖：動(dòng)物血清中和實(shí)驗(yàn)，基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺(tái)。下右圖：通過(guò)CT評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)作用。圖片源自參考資料2。

 

No.2基于轉(zhuǎn)基因牛的抗病毒血清研究

 

在抗擊SARS和流感的臨床療法中，“恢復(fù)期血漿”治療(Convalescent‑phase plasma therapy)獲得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，該法的療效很大程度上依賴于是否能及時(shí)獲得有效的血清。相比下，基于動(dòng)物的超免疫血清雖然能解決量的問(wèn)題，但其使用可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫反應(yīng)和毒性。單克隆抗體療法，又一種基于被動(dòng)免疫的治療方法，面臨耗時(shí)長(zhǎng)和出現(xiàn)耐藥突變病毒株等挑戰(zhàn)。

 

為了解決上述的問(wèn)題，有研究人員將目光轉(zhuǎn)向了轉(zhuǎn)基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)來(lái)快速獲得大量、有效的抗病毒血清。通過(guò)基因工程，研究人員敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亞型人抗體表達(dá)體系，來(lái)達(dá)到免疫系統(tǒng)人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高達(dá)150到600 g的人IgG。目前，已有多項(xiàng)臨床前研究利用該技術(shù)對(duì)抗MERS和Ebola等傳染病[3,4]。在此，我們著重介紹靶向MERS的研究。

 

 

在免疫原段，該研究利用了兩種材料：滅活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的納米材料(SPNV)。兩種免疫原均能刺激產(chǎn)生S蛋白特異的血清和人IgG(SAB-300/301)。基于安全性和生產(chǎn)可行性等因素，研究主要圍繞基于SPNV產(chǎn)生的人IgG開(kāi)展動(dòng)物和臨床研究。

 

上圖：基于轉(zhuǎn)基因牛的免疫過(guò)程。下圖：利用Anti-Spike抗體檢測(cè)所得血清（左）和純化人IgG（右）的有效含量。圖片源自參考資料3。

 

除了特異性檢測(cè)外，研究利用免疫熒光成像技術(shù)，結(jié)合Anti-Spike抗體來(lái)衡量免疫所得血清和抗體的抗病毒中和作用(FRNA50)。相較于只能完成一輪感染的假病毒體系，F(xiàn)RNA50能直觀、全面地反映藥物處理對(duì)于病毒感染能力的影響。在該研究中，此法還結(jié)合mRNA檢測(cè)驗(yàn)證病毒的滅活效果，確保疫苗的安全性。結(jié)合FRNA50和傳統(tǒng)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)測(cè)定法，研究證明純化的血清含有高水平的中和多抗。在過(guò)表達(dá)DPP4的小鼠模型上，無(wú)論是預(yù)防性還是治療性給藥，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已進(jìn)入一期臨床試驗(yàn)。

 

利用FRNA50檢測(cè)所得血清（左）和純化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高內(nèi)涵平臺(tái)和配套微孔板。圖片源自參考資料3。

 

No.3利用ADCC抗擊H7N9禽流感的單抗研究

 

作為腫瘤免疫療法的主要推動(dòng)者，單克隆抗體（單抗）也被廣泛用于抗擊SARS和HIV等多種病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和單抗的研究也為疫苗設(shè)計(jì)提供了新的思路。但是，基于雜交瘤技術(shù)的傳統(tǒng)單抗制備面臨著耗時(shí)長(zhǎng)，步驟多且繁瑣等問(wèn)題，限制了其對(duì)可能出現(xiàn)的新型疫情爆發(fā)的應(yīng)對(duì)能力。相比下，噬菌體展示技術(shù)為快讀獲得高親和力人源單抗提供了新的途徑。基于該技術(shù)平臺(tái)，復(fù)旦大學(xué)研究人員建立超大型天然全人源抗體庫(kù)，并成功鑒定靶向MERS和流感的強(qiáng)力抗體[5,6]。

 

 

在抗擊H7N9流感的工作中，為了獲得低突變的高特異抗體，研究人員以重組表達(dá)的HA和HA1蛋白為抗原，基于健康人B細(xì)胞來(lái)源的天然抗體庫(kù)開(kāi)展多輪篩選，獲得單抗m826。經(jīng)序列分析，研究人員證明m826與胚系基因高度同源，是胚系抗體。相較于體細(xì)胞高度突變的抗體，胚系抗體建立時(shí)間短，安全性高且成藥性更好，適用于靶向急性感染的抗體和疫苗研發(fā)。

 

基于噬菌體展示技術(shù)的H7N9抗體篩選，圖片源自參考資料6。

 

非常有意思的是，在紅細(xì)胞凝集抑制 (Hemagglutination inhibition,HI)反應(yīng)中，m826僅表現(xiàn)出微弱的抗病毒能力。進(jìn)一步的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)檢測(cè)和免疫熒光法中和實(shí)驗(yàn)證明m826不能中和流感病毒，抑制其在靶細(xì)胞的增殖。利用親脂性熒光染料R18和SP-DiOC18（3）來(lái)標(biāo)記病毒，研究發(fā)現(xiàn)m826對(duì)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合和膜融合過(guò)程無(wú)顯著影響。但是，m826能很強(qiáng)結(jié)合表達(dá)H7N9 HA蛋白的細(xì)胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用）活力的強(qiáng)力介導(dǎo)者。同時(shí)，由于不能中和H7N9病毒，m826還能成為高價(jià)值的工具性抗體。在動(dòng)物模型上，IgG1 m826能有效的預(yù)防和控制H7N9的感染。因此，m826依賴于ADCC，而不是中和能力抗擊流感病毒。這一發(fā)現(xiàn)為抗病毒抗體的篩選和研發(fā)提供了新的思路和途徑。

 

左圖：基于免疫熒光成像技術(shù)（熒光標(biāo)記病毒）的中和實(shí)驗(yàn)，H7N4抗體為中和陽(yáng)性對(duì)照。右上：病毒結(jié)合檢測(cè)，紅色熒光探針R18標(biāo)記病毒，感染30分鐘后進(jìn)行成像檢測(cè)。NA為結(jié)合陰性對(duì)照；m336為陰性對(duì)照抗體。右下：利用熒光探針R18和SP-DiOC18（3）雙標(biāo)記病毒，病毒膜融合發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)SP-DiOC18（3）綠色熒光信號(hào)加強(qiáng)。Baf A1為融合陰性對(duì)照。上述高通量成像檢測(cè)均基于Opera或Operetta高內(nèi)涵平臺(tái)。圖片源自參考資料6。

 

No.4靶向膜融合的廣譜抗病毒多肽研究

 

作為動(dòng)物來(lái)源的病毒，冠狀病毒因其多樣性，較高的傳播能力和進(jìn)化能力限制了單一的靶向療法的臨床應(yīng)用。因此，從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)看，能作用于多種冠狀病毒的新型廣譜抗病毒藥物，會(huì)成為抗擊流行性和新型冠狀病毒感染的終極武器。相較于高度變異的受體結(jié)合區(qū)(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)區(qū)高度保守。同時(shí)膜融合也是病毒感染和復(fù)制重要的功能性過(guò)程。因此，該區(qū)域成為了抑制性多肽的研究重點(diǎn)。靶向冠狀病毒的膜融合過(guò)程，來(lái)自于復(fù)旦大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)出廣譜多肽抑制劑EK1，為抗擊冠狀病毒和類似病毒提供了新的大分子治療策略[7]。

 

 

冠狀病毒可通過(guò)胞內(nèi)體膜融合途徑(Endosomal pathway)或/和細(xì)胞表面胞漿膜融合途徑(Non-endosomal pathway)進(jìn)入細(xì)胞。病毒通過(guò)結(jié)合宿主細(xì)胞受體激活其S2亞基的HR1和HR2區(qū)，互相結(jié)合形成對(duì)膜融合至關(guān)重要的6-HB(Six-helix bundle)結(jié)構(gòu)。

 

冠狀病毒的膜融合過(guò)程和競(jìng)爭(zhēng)性多肽工作機(jī)制，圖片源自參考資料7。

 

鑒于此，研究人員以多種冠狀病毒的保守HR區(qū)為模板，合成HR1和HR2區(qū)來(lái)源的多肽（HR1P和HR2P）用于競(jìng)爭(zhēng)。通過(guò)過(guò)表達(dá)技術(shù)，研究進(jìn)一步建立靶向多種冠狀病毒的細(xì)胞細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)性篩查HR1P和HR2P對(duì)細(xì)胞融合的抑制。結(jié)果顯示由OC43株來(lái)源的HR2P具有廣譜且強(qiáng)效的抑制融合能力。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過(guò)引入氨基酸和突變等方法，進(jìn)一步優(yōu)化多肽的可溶性和成藥性。所獲得的多肽EK1，在進(jìn)一步的一系列體外檢測(cè)，包括細(xì)胞細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力檢測(cè)中，都表現(xiàn)出強(qiáng)效的廣譜抗病毒能力。

 

細(xì)胞細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)病毒S蛋白并帶有GFP信號(hào)的293T細(xì)胞為作用細(xì)胞，Huh-7為靶細(xì)胞，圖片源自參考資料7。

 

除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽類藥物的另一優(yōu)勢(shì)是支持非侵入性鼻腔給藥，適合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，檢測(cè)鼻腔給藥下的EK1的體內(nèi)分布非常重要�；�于活體成像技術(shù)，研究觀察到Cy5熒光標(biāo)記的EK1可廣泛分布于整個(gè)呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝臟、腎和脾，都能檢測(cè)到EK1的分布，表明EK1可以進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)和其他臟器中。因此，EK1還可能作用于由冠狀病毒導(dǎo)致的系統(tǒng)性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表現(xiàn)出強(qiáng)力的抗病毒能力，有效抑制了因感染帶來(lái)的體重減輕和死亡現(xiàn)象。從體外到體內(nèi)的多方面安全性評(píng)價(jià)表明通過(guò)鼻腔給藥的EK1是低免疫原性，安全的治療策略。因此，EK1是一個(gè)新型、有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物，值得進(jìn)一步的深入研究。

 

上：基于活體成像檢測(cè)鼻腔給藥下Cy5標(biāo)記的EK1在小鼠體內(nèi)的分布；小動(dòng)物活體成像檢測(cè)基于IVIS平臺(tái)。下：EK1處理對(duì)模型鼠死亡率、體重和病毒滴度的影響，圖片源自參考資料7。

 

總結(jié)

 

通過(guò)上述四個(gè)案例，我們總體介紹了靶向病毒段的大分子療法的研究流程和關(guān)注點(diǎn)。助力此類治療方法的研發(fā)，珀金埃爾默提供成熟的整體應(yīng)用解決方案。針對(duì)攜帶螢火蟲(chóng)報(bào)告基因的假病毒研究，我們提供全面、配套的涵蓋化學(xué)發(fā)光試劑，微孔板和高通量檢測(cè)平臺(tái)的解決方案。對(duì)于基于慢病毒包裝系統(tǒng)的假病毒，我們還可以提供p24檢測(cè)解決方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平臺(tái)的解決方案，我們還可以分析短程和長(zhǎng)程的復(fù)雜亞細(xì)胞活動(dòng)，例如由病毒介導(dǎo)的膜融合過(guò)程。在血清和抗體的篩查和分析中，強(qiáng)大的高內(nèi)涵解決方案能最大程度發(fā)揮表型篩選的優(yōu)勢(shì)，發(fā)現(xiàn)具有中和能力、安全的潛在抗體。同時(shí)，ADCC，作為關(guān)鍵的抗感染抗體工作機(jī)制之一，也是我們的主要應(yīng)用關(guān)注點(diǎn)。針對(duì)ADCC的檢測(cè)，我們提供金標(biāo)準(zhǔn)、靈活的放射和非放射解決方案，助力抗體類藥物的深入評(píng)價(jià)[8]。最后，在臨床前動(dòng)物研究中，除了中和檢測(cè)外，我們提供覆蓋功能到結(jié)構(gòu)的活體成像解決方案，助力病理檢測(cè)、藥物分析和藥效評(píng)價(jià)等核心工作。

 

參考文獻(xiàn)

 

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4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218（Suppl 5）: S636–S648.

5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.

6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22（4）: 471–483.e5.

7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5（4）: eaav4580

8. DELFIA經(jīng)典技術(shù)應(yīng)用于單抗研發(fā)及細(xì)胞治療——AD0116細(xì)胞殺傷專題之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ