inscopix神經(jīng)元超微鈣成像系統(tǒng)在探究嗜酒如命天性的應(yīng)用

剛過去的這個春節(jié)可謂幾十年來最不尋常的一個，一場突如其來的疫情打亂了我們所有的計劃。在大年初一的那天開始，各地都進入了封閉狀態(tài)，一切計劃中的歡慶都未曾開始。鬧區(qū)依然不見了，往年春節(jié)時的大吃大喝觥籌交錯的場景消失了。然而，這個春節(jié)因為醉酒而發(fā)生的事故必然創(chuàng)歷史最低。以往春節(jié)里，迎來送往必不可少，總會有人喝多了酒記不起回家的路。

據(jù)統(tǒng)計，超過80％的成年人在其一生中會不同程度的攝取酒精，其中有不到30％的人會發(fā)展為酒精使用障礙（alcohol use disorder，AUD）。

那么，酒精為什么會在個體之間產(chǎn)生如此不同的結(jié)果？酗酒是天生的嗎？還是后天習(xí)慣養(yǎng)成？
在小鼠身上做的實驗有助于理解這個事情。

講解之前，我們先了解一個概念：強迫性飲酒，就是在體會到飲酒的痛苦之后依然喜歡酗酒，這是酒精使用障礙的一種特征。對絕大多數(shù)的人來說，酒都不是一種比果汁更美味的存在，所以酒精使用障礙是一部分人嗜酒的原因。

研究人員在小鼠身上再現(xiàn)人類酗酒并體驗酗酒痛苦的過程，并讓體會到酗酒痛苦后的小鼠再次飲酒，觀察小鼠是否愿意在知曉痛苦后仍義無反顧地飲酒。

研究人員將小鼠分成3組，每組小鼠先期經(jīng)過3天的只提供酒（15%）的訓(xùn)練（第1-3天）；
接著從第4天開始，在酒里逐步添加更多劑量的奎寧，持續(xù)2天（第4-5天），奎寧作為一種苦味劑，使小鼠感受到飲酒的痛苦；

接著進行的就是14天的無限制提供飲酒和水，模擬酗酒行為，3個小組分別每天有2，4，6個小時進行無限制飲用時間（第6-19天）；

酗酒訓(xùn)練結(jié)束后，恢復(fù)只提供飲酒，持續(xù)3天（第20-22天）；

最后4天，提供飲酒+奎寧（第23-26天）（圖1A）。
 
研究人員發(fā)現(xiàn)，不同小鼠個體在實驗中表現(xiàn)出了較大的差異（圖1B）。

根據(jù)小鼠在酗酒期的飲酒行為，他們將小鼠分為了3種類型，（1）一直飲酒較少，與酒中的奎寧濃度無關(guān)，稱作低飲酒鼠。（2）飲酒較多，但對奎寧酒的處理較敏感，稱作高飲酒鼠。（3）飲酒較多，并且對奎寧酒的處理惰性較強，依然保持高飲酒量，稱作酗酒鼠（圖1C）。

酗酒訓(xùn)練過后，低飲酒鼠的酒精攝入量有所減少；高飲酒鼠在酗酒訓(xùn)練后對奎寧酒的敏感性有所增加；酗酒訓(xùn)練前，酗酒鼠表現(xiàn)出對奎寧酒的高耐受力，酗酒訓(xùn)練后，這種耐受力更加有所增強。（圖1D-H）
  根據(jù)以往研究，內(nèi)側(cè)前額葉皮層（mPFC）在介導(dǎo)包括強迫性成癮在內(nèi)的病理性嗜藥行為中起著至關(guān)重要的作用，嗜酒行為也算其中一種。而既往損傷或酒精引起的PFC功能變化均可導(dǎo)致出現(xiàn)適應(yīng)不良的行為，也會導(dǎo)致強迫性飲酒的出現(xiàn)。而導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）參與對厭惡事件的反應(yīng)，包括戒酒期間的負面情感狀態(tài)和痛覺過敏。從mPFC投射到背側(cè)PAG的神經(jīng)元（mPFC-dPAG）編碼對厭惡事件做出的行為。而mPFC-dPAG神經(jīng)元的功能缺陷可能會破壞這一過程，從而導(dǎo)致強迫性飲酒。

為了知曉這些不同類型鼠在飲酒實驗中的表現(xiàn)是不是有這種神經(jīng)結(jié)構(gòu)上的先天因素，接下來的實驗里，在飲酒實驗前對小鼠的大腦進行了植入式的神經(jīng)鈣活動成像。在實驗全程進行信號記錄觀察，所用的儀器是由格羅貝爾為中國授權(quán)代理的inscopix公司nVista微型顯微成像設(shè)備。這個設(shè)備可以在小鼠進行行為學(xué)實驗及自由活動期間對其大腦內(nèi)的神經(jīng)鈣活動信號進行實時觀察及記錄。整個顯微鏡埋植在小鼠頭骨上，由一根自聚焦透鏡深入腦內(nèi)部，根據(jù)透鏡長度可以進行表面大腦皮層的觀察和深部腦區(qū)如海馬，紋狀體等的觀察。透鏡有0.5mm、0.6mm、1mm直徑的選擇，整個透鏡重約2克，小鼠完全可以在清醒狀態(tài)下進行各種自由行為活動。根據(jù)調(diào)整內(nèi)部液體透鏡的電子對焦，其焦平面變化可變范圍達300微米，借助鈣指示病毒表達的綠色熒光蛋白可以清晰顯示神經(jīng)元胞體、軸突的脈沖式鈣活動，反映神經(jīng)環(huán)路中的具體實時活動。
研究人員將Cre依賴性表達GCaMP6m的順行追蹤病毒注射到mPFC中，將攜帶Cre重組酶的逆行追蹤病毒注射到dPAG中（圖2A），通過顯微鏡可以觀察到神經(jīng)元成像（圖2B）并可以提取神經(jīng)元活動（圖2C）。研究人員在實驗酗酒訓(xùn)練前的階段從記錄到的鈣信號中找出了352個神經(jīng)元活動，并對其進行了聚類分析（圖2D-E）。
  整個實驗完成后，研究人員發(fā)現(xiàn)，在第1天飲酒中，酗酒鼠比低飲酒鼠腦中有更多的mPFC-dPAG神經(jīng)元表現(xiàn)出抑制反應(yīng)，飲酒期間，低飲酒鼠比酗酒鼠的mPFC-dPAG神經(jīng)元有更強的興奮性（圖2F，G，H）。此時各類型小鼠尚未表現(xiàn)出飲酒行為上的差異。但這種神經(jīng)元興奮上的差別已顯示出與2周酗酒實驗之后的飲酒行為有相關(guān)性（圖2I，J，K）。 那改變這種神經(jīng)元活動是不是會對小鼠之后的飲酒行為產(chǎn)生影響。
研究人員在小鼠大腦雙邊的mPFC神經(jīng)元均表達了鹽視紫紅質(zhì)（NpHR），并在雙邊dPAG植入了光纖，以進行神經(jīng)元的光遺傳抑制。在小鼠飲酒或水的過程中，嘴舔到瓶嘴即觸發(fā)光抑制。對照組則沒有光遺傳抑制。酒瓶里則添加了更高濃度的奎寧，以模擬最高程度的飲酒懲罰。

實驗發(fā)現(xiàn)，有光遺傳抑制的小鼠飲酒比對照組增加了兩倍以上，但是水的消耗并沒有受到影響。而不會影響水消耗（圖3A-G）。 然后實驗增加了腳下電擊設(shè)置，小鼠每次舔舐酒瓶嘴都會觸發(fā)電擊，這種情況下，光遺傳抑制依然可以再次促進飲酒行為（圖3H-I）。 為了確定mPFC-dPAG神經(jīng)元活性的光抑制是否通過增加酒精的效果或降低對懲罰的敏感來促進飲酒行為，研究人員對每項成分進行了單獨實驗，發(fā)現(xiàn)在沒有懲罰情況下，光抑制不會促進酒消耗（圖3J-K）。 在類似的痛苦體驗實驗中，在將鼠尾浸入50℃水中，光抑制可以使小鼠撤出尾巴前的忍受時間變長。一方面奎寧對機體并不會有明顯的痛覺刺激，另一方面這一神經(jīng)環(huán)路對有害刺激又有類似反應(yīng)，因此，光遺傳抑制mPFC-dPAG神經(jīng)元活性其實是改變了小鼠對厭惡事件的反應(yīng)。

為了測試激活這一神經(jīng)環(huán)路對飲酒的影響，研究人員在mPFC-dPAG神經(jīng)元中雙向表達了ChR2，一種光激活蛋白，并在mPFC上植入了光纖。并在分析時避免對另一側(cè)的腦區(qū)造成影響，以保證實驗鼠正常的運動和情緒反應(yīng)（mPFC控制著相應(yīng)功能）。這次實驗中，瓶嘴的舔舐觸發(fā)光遺傳激活。實驗過程中，隨著光刺激的功率不斷增加，酒精舔舐不斷減少，而飲水則沒有變化，這一神經(jīng)環(huán)路的光遺傳激活作用類同大腦獎賞反饋中的懲罰，這是成癮行為的標(biāo)志（圖4）。 研究表明，在小鼠身上，飲酒行為與其先天的神經(jīng)表型是有明顯的相關(guān)性的，對厭惡通路的抑制或者缺失使得小鼠更愿意嘗試具有痛苦體驗的事物。同樣的原理在人身上也極有可能以類似的形式存在著。從實驗中可以看出，飲酒的痛苦是真實的，即便是對于酗酒小鼠，在酗酒訓(xùn)練后，對其也是種強烈的刺激，并且會不斷增加閾值，這種刺激雖然于它在神經(jīng)層面是一種痛苦免疫的情形，但也只是降低了痛苦的感知，對機體其他方面的損害卻是沒有絲毫減少的。

對于人來說，為了自己和家人的健康，酒還是少飲為妙，因為可能在你不知不覺中，你的大腦就會對它索取超過你身體可以承受的多。

參考文獻：
Siciliano C A , Noamany H , Chang C J , et al. A cortical-brainstem circuit predicts and governs compulsive alcohol drinking[J]. Science, 366