雙轉盤共聚焦技術：長時間活細胞3D動態(tài)觀察和分析利器

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅識別某一特定抗原表位的抗體，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等眾多優(yōu)點。單克隆抗體技術的問世經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段，這些工程改造抗體不僅為免疫學領域帶來了一次革命，而且在生物醫(yī)學的各個領域得到極廣泛的應用。如今在臨床上，單克隆抗體也被廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應等多種疾病的治療。
 

在單抗藥物研發(fā)的早期階段，目前普遍的共識是：抗體是篩出來的！這就要求對整個篩選規(guī)模的通量和自動化有較高的要求，并在合適的方法學模型下“大浪淘沙”，獲得真正有效的hit！然而，目前單抗藥篩選方法無論是ELISA還是FACS，雖然沿用多年，但都存在種種缺陷和不足：
 

1.整個樣品準備過程流程復雜，步驟繁瑣，中間涉及到多次的離心、洗滌、孵育再離心和洗滌孵育的過程，費時費力。

2.ELISA：具備一定的通量并能實現(xiàn)自動化，但是實驗結果基于純化的包被抗原，無法獲得符合真正生理情況下細胞水平的數(shù)據(jù)，往往導致假陽性過高，一般只作為初篩。

3. FACS：通量較低，雖有高通量的流式細胞儀問世，復雜繁瑣的樣品準備流程依舊是個短板，無法滿足日益增加的篩選通量需求。此外FACS容易堵塞，需要清洗，維護麻煩，更無法實現(xiàn)機械臂整合后的自動化。

二、mirrorball：一步法，真正的免洗
 

由于ELISA和FACS的種種缺陷，英國著名的創(chuàng)新實驗室自動化儀器廠商SPT Labtech為此研發(fā)了新一代的抗體藥物篩選平臺mirrorball，其獨有的均相混合即讀模式（Mix & Read）是專門為細胞水平的高通量抗體篩選所設計。實驗時，只需將細胞（無論是貼壁還是懸�。┗蛭⒅�、待測的抗體（如雜交瘤上清）以及熒光二抗混合在一起孵育，直接讀板，獲得數(shù)據(jù)，中間不需要任何洗滌的步驟。
 

真正的一步法檢測
 

mirrorball 免洗原理：底讀+雙染

首先，mirrorball的激光只會讀取沉降到微孔板底部的細胞，從而避免細胞上方背景熒光二抗的干擾。

僅排除上方的背景信號是不夠的
 

其次，用活細胞染料如Dio或CFSE標記細胞，加入待測的一抗以及相應的紅色熒光二抗如Alexa647，同時能檢測到綠色和紅色信號的細胞即為陽性結合，紅和綠的共定位，在儀器中顯示為黃色信號，從而排除背景的熒光二抗。
 

雙陽的共定位細胞即為陽性孔

三、mirrorball主要應用

1. 針對細胞表面抗原的抗體篩選：這是mirrorball最常見也是最廣泛的應用。例如在感興趣靶點的細胞上，加入待測的一抗如雜交瘤上清、細胞染料和熒光檢測二抗，中間無需任何洗滌過程，孵育1-2小時后直接讀板檢測，同時有細胞和熒光二抗共定位信號的孔即為陽性結合孔。
 

384孔雜交瘤篩選workflow


384孔板結果，綠色為陽性孔


可導出直觀的hot map
 

2. 多重檢測(multiplex):mirrorball可以在一個孔內(nèi)同時檢測陰性和陽性對照并進行多指標分析。具體方法為,用藍色的染料如Hoechst標記陰性細胞，用綠色染料如Dio標記陽性對照細胞，將兩種細胞混在一起后，在加入待測的抗體以及相應的熒光二抗。mirrorball能區(qū)分并準確定位每個孔內(nèi)的綠色和藍色細胞，同時分別統(tǒng)計綠色和藍色細胞上紅色熒光二抗的信號。在這個實驗中，只有綠色陽性細胞上有紅色抗體信號同時藍色細胞上沒有的孔才是真正的陽性孔。這個實驗無論ELISA還是流式都必須做兩次，mirrorball可一步完成，節(jié)省一半的試劑和試劑耗材。

多重檢測protocol

 

3. 微珠檢測：除了細胞水平的篩選外，mirrorball也可以采用和ELISA類似的方法，將純化的抗原（標記biotin）包被在帶SA的微珠上，同樣可進行抗體的篩選。相比于ELISA，不但免洗而且所需抗原包被的用量僅為ELISA的1/10，可節(jié)省寶貴的抗原。

mirrorball可檢測微珠上的散射光
 

此外，mirrorball也可以進行基于微珠的多重檢測和分析，市場上可以買到不同大小的微珠或者不用顏色的微珠，在同一孔內(nèi)，mirrorball可以準確定位和區(qū)分這些不同大小和顏色的微珠，并分別檢測上面是否有陽性的抗體結合。

利用不同的微珠進行多重分析
 

4. 競爭結合實驗：mirrorball上還可以實現(xiàn)免洗競爭結合實驗。例如 類似于競爭性ELISA。步驟很簡單，在微珠上包被二抗，然后加入固定量的熒光標記一抗和待檢測的一抗，混合在一起，孵育一段時間，讀板獲取分析數(shù)據(jù)，并獲得相應的IC50。

競爭結合實驗protocol及分析結果
 

5. 全自動，整合機械臂：mirrorball可整合機械臂機和疊板架，一天可輕松完成80塊384孔板的篩選通量，其中樣品準備的時間小于2小時，實現(xiàn)真的無人值守式的抗體篩選新模式。

無人值守，高通量篩選


四、結束語

mirrorball自問世以來，以其簡潔、快速和高效的抗體篩選模式，廣受諾華，羅氏，Genentech，禮來，GSK，藥明康德，睿智化學，恒瑞，和鉑，岸邁，三生國建，華海藥業(yè)等各大跨國藥企、生物技術公司和CRO的青睞。mirrorball致力于用更簡單的流程、更少的抗原用量、更低的人力和試劑成本、更高的通量去篩選到更好質量的抗體！