Inscopix在獼猴大腦背外側運動前皮質(zhì)實現(xiàn)頭戴式顯微鈣成像的應用

Inscopix系列的大腦超微鈣成像系統(tǒng)一般用在嚙齒類動物身上的居多，因為設備體積小，重量輕，且在實驗時動物可以自由活動而成像質(zhì)量不受影響，因此受到了很多神經(jīng)科學研究者的青睞。
 
但在最近的一篇來自Inscopix公司和美國德克薩斯大學奧斯汀分校的研究人員在bioRxiv上發(fā)表的文章則描述了inscopix nVista頭戴式顯微鈣成像設備應用在獼猴身上的研究，該研究將兩個inscopix鈣成像設備埋植在獼猴左右兩側的大腦上，對采集到的鈣離子活動信號通過數(shù)學模型的分析解碼，實現(xiàn)了將神經(jīng)信號與行為動作的解讀關聯(lián)。實驗方法并不復雜，并且還實現(xiàn)在清醒可自由動作的靈長類動物上。下面我們對這篇文章的實驗及分析過程進行介紹。
 
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文章首先對在獼猴頭上安裝頭戴式微型顯微內(nèi)窺鏡的手術操作進行了講解，手術環(huán)節(jié)分為兩個部分，第一是將病毒注射到感興趣的大腦區(qū)域以表達經(jīng)過基因編輯的鈣指示蛋白，第二個是將長期型內(nèi)窺透鏡植入到目標位置（圖1）。
 
對于獼猴皮質(zhì)中表達鈣指示蛋白，他們采用了兩種基于AAV的略（圖1B），一種是使用傳統(tǒng)AAV表達實現(xiàn)基于GCaMP的鈣成像，第二種是將兩種病毒混合在一起構成AAV Tet-Off病毒系統(tǒng)。與常規(guī)策略相比，該系統(tǒng)可在較短時間內(nèi)表達較高水平的GCaMP，它的GCaMP表達是TET依賴的，因此對動物施用強力霉素可暫時抑制GCaMP的表達，這對于在長期成像中防止發(fā)生過度表達很重要。經(jīng)過試驗，這兩種方法均可在皮質(zhì)中產(chǎn)生足夠的GCaMP6f表達，并在皮質(zhì)各個位置均有充分分布。觀察表達GCaMP的細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在CaMK2a病毒參與下，蛋白表達偏向于興奮性錐體神經(jīng)元；而在Tet-Off病毒系統(tǒng)下，則偏于泛神經(jīng)元表達，這與以前的報道一致。與傳統(tǒng)只表達CaMK2a病毒相比，Tet-Off病毒系統(tǒng)在注射后的相同時間點可以觀察到更高的表達水平。
 
他們將成像區(qū)域定為大腦左右兩側的背外側運動前皮層（PMd）前肢區(qū)域，依靠實驗前掃描得到的猴腦MRI圖像以及標準解剖圖集對猴腦建立立體圖像以確定實驗坐標。在左半球的PMd，注入Tet-Off病毒系統(tǒng)的兩種病毒；在右半球PMd，注入AAV1.CaMK2a.GCaMP6f。實驗中對病毒注射位點拍照記錄，在顱骨上做基準點標記，并在硬腦膜切開處使用人工硬腦膜以防止切口處軟腦膜和蛛網(wǎng)膜上的心血管生成，這樣在后續(xù)埋植透鏡時能更準確地找到病毒注射位置。在腦中植入的是斜端面透鏡，植入位置在皮質(zhì)下面2mm處，在猴顱骨上擰入骨螺釘，將埋入的透鏡，顯微鏡底座，以及一個定制的可以包住整個埋植透鏡的帶蓋腔室，一起用水泥/丙烯酸樹脂固定在頭骨上（圖1A）。由于顱骨切口完全用/丙烯酸樹脂密封，植入物感染風險低，幾乎不需要維護。一旦完成上述兩個手術步驟，就可以對動物進行鈣成像觀察記錄了。
 
 

   
 
細胞級別分辨率的鈣成像
 
透鏡植入手術后大約兩周就可以觀察細胞鈣活動。這種頭戴式微型顯微鏡和植入設計的主要優(yōu)勢在于，它操作簡單，插上顯微鏡即可觀察。放置顯微鏡時，猴子可舒適的坐在工學設計的標準靈長類動物椅子上，頭部被暫時限制活動以完成微型顯微鏡對接，將軟墊靠在猴頭側面，將腔蓋拿開，取下微型鏡底板上的保護蓋，將微型鏡對接至底板，擰緊固定螺釘，不到2分鐘即可完成整個操作，然后放開動物頭部開始成像。
 
在透鏡植入兩周后進行的第一個成像過程中，研究人員觀察到了表達GCaMP的細胞和相應的細胞鈣活動，實驗猴進行伸手任務，成像觀察4周后，活動細胞數(shù)量開始上升并達到相對穩(wěn)定的值（圖1C-F）。成像過程中，動物頭部完全不受約束，可自由移動和咀嚼食物。盡管實驗動物的下頜，頭部和身體有明顯的運動，但成像視野還是非常穩(wěn)定的，僅通過標準的剛性平動校正算法就可在整個記錄過程中精確記錄幀。實驗期間，在所有記錄的視頻幀中，應用校正值的中位數(shù)為0.75μm，比成像細胞的平均大小要小一個數(shù)量級。運動校正后，頭部運動與視野平移之間的微小誤差可以完全緩解。
 
數(shù)據(jù)分析使用了CNMFe（constrained nonnegative matrix factorization，一種用于從單光子微內(nèi)窺鏡鈣成像數(shù)據(jù)中識別細胞的常用算法）來識別單個細胞并提取其細胞鈣活動。在展示的左半球記錄示例中，算法確定了106個單細胞（圖1C-D）。鈣事件具有足以通過標準事件檢測算法的信噪比，且鈣離子活動符合預期的典型模式，有快速上升和指數(shù)衰減的特性（圖1E）。在這個記錄里（圖1F），整個神經(jīng)元群中測到的信噪比和事件發(fā)生率均與在嚙齒動物模型的鈣成像研究中通常觀察到結果相似。右半球PMd的成像細胞明顯減少，可能是由于透鏡相對于表達GCaMP的細胞區(qū)域的放置位置不是最佳。但從這些細胞中檢測到的鈣事件與從左半球細胞中觀察到的信噪比和事件發(fā)生率是相似的。
 
 
在長期鈣活動記錄中追蹤單個神經(jīng)元群
 
研究人員在不到8個月中一共進行了66次成像記錄，在開始4個月中連續(xù)進行了42次記錄（圖2A），之后暫停。動物全身注射熒光染料以進行鎮(zhèn)靜血流成像，經(jīng)一個月后，恢復了鈣活動成像，但血液熒光染料完全干擾了檢測GCaMP熒光信號的能力。研究人員在第6個月繼續(xù)進行鈣成像，測試Dox給藥對測得的鈣活動的影響。從第0天到第76天的32個成像階段中（圖2A），結果令人滿意，總體成像質(zhì)量和鈣活動保持穩(wěn)定（圖2B-C）。左半球PMd中識別出的細胞數(shù)在間隔的記錄之間波動，但總體相對穩(wěn)定，記錄細胞中位數(shù)為104個 [四分位數(shù)IQR 91-113] （圖2B）。信噪比和檢出鈣事件率在各試驗記錄中也是相對穩(wěn)定的，在右半球PMd的成像細胞中也觀察到了相似的穩(wěn)定性（圖2C）。
 
比較左右半球細胞群在整個實驗過程中的鈣事件衰減，發(fā)現(xiàn)左半球的衰減明顯比右半球慢，這在兩個半球的SNR參數(shù)相同的情況下，表明左半球高表達GCaMP的細胞數(shù)量比右半球多，這也與組織學結果一致，表明在注射后的相同時間點，Tet-Off病毒系統(tǒng)會產(chǎn)生比常規(guī)CaMK2a病毒策略更高水平的表達。鑒于GCaMP過度表達會引發(fā)癲癇和細胞毒性，因此對于長期成像實驗而言，將表達水平保持在合理范圍內(nèi)非常重要。研究人員另外測試了Dox給藥對測得的鈣動力學的影響。如預期的那樣，Dox的使用導致GCaMP表達水平顯著降低。使用Dox 8天后停用3天，鑒定出的細胞數(shù)量從75減少到0，施加Dox還會加快鈣事件的衰減。停用Dox大約40天后，整個視野的平均熒光，鑒定的細胞數(shù)量和熒光衰減都恢復到Dox之前的水平。在第一次記錄算起的第8個月進行的成像記錄中，成像質(zhì)量，鈣動力學和事件發(fā)生率與前4個月記錄的結果相當。這些結果表明，Tet-Off病毒策略表達GCaMP可在長達數(shù)月的長期成像中將指示蛋白表達維持在可接受水平內(nèi)。
 
 

   
 
因為實驗中的成像質(zhì)量和鈣活動檢測的整體穩(wěn)定性比較好，研究人員嘗試追蹤單個神經(jīng)元，這是鈣成像相比電生理的主要優(yōu)勢。對兩個在不同時間點記錄的鈣活動錄像，他們首先用CNMFe提取兩次記錄中的細胞圖，記錄細胞位置，這樣每個細胞就有相對于其他細胞的相對位置（圖2D）。通過計算兩組數(shù)據(jù)中的關聯(lián)位置，檢測推算其中的相同細胞�？臻g相關性分數(shù)高于閾值的細胞對被推定為相同細胞。對于圖示的記錄匹配，實驗方法能夠?qū)⒌?9天成像的細胞中的63％識別為第36天成像的相同細胞。在對所有成像進行計算后，在最小間隔1-4天的記錄中，有中值約為70％的細胞可確認為同一細胞，在間隔67-73天的記錄中，有約40％為同一細胞（圖2E）。進一步嘗試是否可以通過多個連續(xù)的成像記錄而不是簡單地通過任何兩個記錄來追蹤相同神經(jīng)元。實驗研究了7個成像記錄的集合，跨越大約3周時間，應用自定義縱向匹配算法（圖2F），在多個成像記錄中跟蹤相同的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)有68個細胞只在一個記錄里活躍，有17個細胞7個記錄里都活躍。這些結果證實了這種成像方法可以在數(shù)月的時間里對活動獼猴腦中大量神經(jīng)元鈣活動進行成像，且成像質(zhì)量具有足夠的穩(wěn)定性，可以長時間縱向追蹤單個神經(jīng)元。
 
 
綜合神經(jīng)元鈣活動，解碼自然伸手動作
 
接下來，研究人員將神經(jīng)元的鈣離子活動與動物動作進行直接關聯(lián)。首先訓練動物的伸手動作，在動物面前有左右兩個位置，隨機交替放置食物獎勵，動物伸手取食（圖3A）。根據(jù)先前的電生理實驗研究，預期是在動物伸出左手或右手時，其神經(jīng)元活動對其伸手方向有選擇性活躍，對側手臂活動對神經(jīng)活動有響應。實驗結果證實了期望，在圖表展示的左半球記錄中，動物正用右臂伸手，幾個神經(jīng)元在向區(qū)域1和區(qū)域2伸手期間，鈣離子活動均有增加且發(fā)生鈣事件的可能性更高，其他細胞則表現(xiàn)出對伸手到區(qū)域1相比區(qū)域2有更多的鈣活動，反之亦然。圖表的三個示例清楚地展示了神經(jīng)元獨特的選擇傾向（圖3B），無論是鈣事件還是在鈣離子活動變化上。
 
在示例記錄里可觀察到，整個成像細胞群體的鈣活動變化與伸手動作調(diào)節(jié)的多樣性，大多數(shù)細胞表現(xiàn)出與一個或兩個伸手方向相關的活躍變化（圖3C）。研究人員計算了一個調(diào)整指數(shù)，來捕捉每個細胞在整個細胞群中對伸手方向的選擇性程度（圖3D）。實驗完成后，他們用該指數(shù)將細胞分為1區(qū)選擇性，2區(qū)選擇性和非選擇性細胞，發(fā)現(xiàn)在78個細胞中有35個為選擇性細胞，1區(qū)占20％，2區(qū)占17％。他們將這種方法應用每個記錄中，發(fā)現(xiàn)在不同記錄中存在相同比例細胞對區(qū)域1和區(qū)域2有選擇性（圖3E）。將所有記錄里的細胞用該指數(shù)分類，然后將經(jīng)過分類細胞的分布重新映射到大腦的成像視野里，評估PMd是否在空間上組織了伸手方向的選擇性（圖3F）。在這些選擇性映射圖中，沒有發(fā)現(xiàn)任何明顯的空間組織。為了測試具有類似選擇性的細胞是否傾向于分布位置更靠近一些，研究人員計算了一個聚類指標，即最鄰近細胞具有相似選擇性的頻率。度量值顯著大于0.5表明類似選擇性細胞群集。對于圖3F中所示的記錄，聚類指標為0.57，但與0.5沒有顯著差異。本研究中使用的GRIN斜端面透鏡允許同時成像散布在多個皮質(zhì)層上的細胞。在評估了方向選擇性細胞所占比例與特定皮質(zhì)層的關系后結果發(fā)現(xiàn)，在視野內(nèi)皮質(zhì)的全部深度上，具選擇性細胞的比例相當均勻。
 
 

   
 
考慮到所記錄的細胞群中對伸手位置選擇性的鈣活動，研究人員猜想是否可以用細胞群體鈣活動經(jīng)多次試驗來逐步解碼動物伸手方向。使用偏最小二乘判別分析和留一法交叉驗證，從400 ms（幀長度100 ms）記錄里所有被識別細胞的連續(xù)鈣活動變化中解碼伸手方向（圖3G）。解碼結果的準確率遠大于隨機水平，并在手進入相應選擇區(qū)域時達到峰值。不同記錄之間的解碼準確性保持穩(wěn)定。盡管相對于連續(xù)鈣活動記錄，鈣事件數(shù)據(jù)量較少，但基于鈣事件解碼的準確性也大大超過隨機概率（圖3G）。如同預期，解碼精度取決于訓練解碼器所用的信元數(shù)量，即便只有一個訓練信元，準確性依然高于隨機水平。
 
 
跟蹤隨時間變化的細胞群體鈣離子活動與動物行為之間的關系
 
已經(jīng)確定猴腦左右半球PMd神經(jīng)元鈣離子活動均表現(xiàn)出對伸手方向具有選擇性（圖3），并驗證了鈣成像方法跨時間縱向跟蹤神經(jīng)元群的能力（圖2），研究人員接下來研究單個神經(jīng)元的方向選擇性隨時間推移的變化或保持穩(wěn)定的程度。他們將分析重點放在了左半球的部分記錄上，在這部分記錄里動物完成了足夠數(shù)量的伸手試驗，跨2個星期，進行了5次記錄（圖4A）。圖示記錄中，已在空間上標定了它們的細胞映射，并推定了82個同一細胞（圖4A），然后比較兩個記錄里同一細胞的調(diào)整指數(shù)，觀察到顯著的相關性，且總體調(diào)整指數(shù)沒有變化（圖4B）。時間間隔增加后，兩個記錄之間調(diào)整指數(shù)的相關性仍然很高，調(diào)整指數(shù)變化仍然很低，這表明PMd細胞經(jīng)過2周時間仍具有穩(wěn)定的方向選擇性（圖4C）。
 
 

   
根據(jù)跨時間追蹤細胞測得的總體調(diào)整指數(shù)相對穩(wěn)定，研究人員預測，用特定記錄的鈣活動變化訓練解碼器，然后對記錄自其他時間點的鈣離子活動進行解碼也會表現(xiàn)得相當好。示例的兩個記錄，在對原記錄和跨一天記錄的測試中，解碼精度均遠高于隨機水平（圖4D）。把記錄間隔時間加長，大多數(shù)情況下，峰值解碼精度仍高于隨機水平（圖4E），這表明PMd對伸手方向的編碼在幾天到幾周內(nèi)相對穩(wěn)定。對這些神經(jīng)元的縱向跟蹤增進了我們對神經(jīng)活動與行為之間動力學關系的理解。
 
 
背外側運動前皮質(zhì)多個部位的雙側鈣離子成像
 
迄今得到的結果分別來自左半球或右半球PMd，而動物伸展手臂在記錄半球?qū)�側。在�?0天到第76天的記錄中，研究人員還同時從兩個半球成像（圖5）。由于微型鏡的體積小，頭部上有足夠的空間來安裝兩個微型鏡，如果研究有需要甚至可以容納更多的鏡頭。為了利用雙邊成像功能，首先對動物進行訓練，使其執(zhí)行類似前述實驗的動作，只不過訓練動物用右臂伸到區(qū)域1，用左臂伸到區(qū)域2（圖5A）。這樣與左右半球PMd的同時記錄相結合，使他們能夠在逐次試驗的基礎上研究手臂伸張如何在大腦兩側進行編碼的。
 
實驗證明左右半球均有同側或?qū)�側伸手選擇性的細胞鈣活動（圖5B-C）。在圖5所示的雙邊記錄中，有些細胞在同側伸手和對側伸手時均有增加的鈣活動，有些細胞在對側伸手時鈣離子更加活躍，有些則在同側伸手時鈣離子更加活躍。每個半球的三個示例清楚展示了這些選擇性（圖5B）。研究人員在雙邊成像的細胞群中觀察到了大量與伸手相關的鈣離子活動調(diào)節(jié)差異（圖5C）。大多數(shù)細胞顯示出與對側伸手有關的顯著活動調(diào)節(jié)，但仍有少數(shù)細胞對同側伸手敏感。
 
 

   
 
鑒于在兩個半球記錄中的神經(jīng)元對同側和對側伸手均存在選擇性，研究人員嘗試是否可以使用雙側整體的細胞鈣活動來解碼發(fā)出動作的手臂身份。如前所述，他們采用留一法交叉驗證的模型，以100毫秒幀的400毫秒幻燈片連續(xù)鈣活動來解碼左臂或右臂動作。在此示例記錄中，解碼精度遠高于隨機，并在進入?yún)^(qū)域時達到峰值（圖5D）。峰值解碼精度在整個記錄中穩(wěn)定（圖5E）。這些結果證實了同步多點成像的可行，并給出了初步數(shù)據(jù)，應用這些功能加深了我們對雙邊編碼伸手動作的理解。
 
 
參考文獻：
Anil Bollimunta, Samantha R. Santacruz, Ryan W. Eaton, Pei S. Xu, John H. Morrison, Karen A. Moxon, Jose M. Carmena, Jonathan J. Nassi. Head-mounted microendoscopic calcium imaging in dorsal premotor cortex of behaving rhesus macaque. 
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.10.996116v1
 
Inscopix的nVista™和nVoke™解決方案在世界重要刊物上已發(fā)表100多篇文章，使科學家們對大腦有了更深刻的認識，進而描繪出動物自由活動時大腦清晰活躍的神經(jīng)網(wǎng)絡。