ICR Swabs對隔離器手套表面低水平微生物的檢測應用
ICR Swabs對隔離器手套表面低水平微生物的檢測應用
在日常的環(huán)境監(jiān)測中，接觸碟法和棉簽擦拭法是對藥品無菌灌裝線進行表面微生物監(jiān)測的常用方法，在現(xiàn)行的歐洲和美國GMP指南中都均有推薦和介紹，但由于取樣方法、試驗表面和測試微生物的不同，擦拭法和接觸碟取樣在微生物的回收率上會存在一些差異。
這種差異在USP <1116>中也有說明，但兩種方法都可檢測低水平的微生物污染，尤其是在A級潔凈區(qū)和隔離器中。
目前，使用隔離器進行藥品的生產(chǎn)，已成為制藥行業(yè)的一種顯著趨勢，因此對隔離器中的試驗表面進行微生物檢測是十分必要的，尤其是隔離器專用的Neoprene®手套。因此，為證明ICR Swabs取樣拭子可有效的檢測出隔離器Neoprene®手套表面的低水平微生物污染，我們進行了專門的實驗研究。
材料和方法
將Neoprene®手套試樣清潔并高壓滅菌。取4種試驗微生物在兩種不同稀釋度的菌懸液，在試樣表面接種，使其均勻分布。表1列出了所選取的試驗微生物以及接種在測試表面的菌落數(shù)CFU。革蘭氏陰性菌的接種量會更高一些，因為它們對接種表面材料的干燥過程更為敏感。
使用平板涂布法在90mm TSA平板上接種，以確定接種在試樣表面的菌落數(shù)CFU。
表1：所選取的試驗菌株和接種在100ul菌懸液中的菌落數(shù)CFU
接下來，在超凈工作臺中，我們將每個表面試樣干燥60分鐘，并用以下不同方法對干燥后的表面試樣上的試驗微生物進行3次重復檢測，操作步驟描述如下，如圖1所示。
1）接觸碟法：用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（含卵磷脂、聚山梨酯80、組氨酸和硫代硫酸鈉）對干燥表面試樣進行取樣，在測試表面均勻按壓10秒。所有平板都在30–35°C培養(yǎng)長達七天，并每日進行菌落計數(shù)。
3）棉簽擦拭法：用已預濕潤的ICR Swabs取樣拭子頭在干燥表面上小心沿水平和垂直方向擦拭取樣。隨后將ICR Swabs頂部的TSB液體培養(yǎng)基擠進拭子頭的試管中，由于干燥可能會延長微生物生長的遲緩期，所以將Swabs取樣拭子30–35°C培養(yǎng)長達七天，并每日目視檢查觀察試管的濁度情況。
培養(yǎng)長達7天并每日進行觀察（ICR接觸碟通過菌落數(shù)CFU來計數(shù)，Swabs取樣拭子通過觀察培養(yǎng)基濁度測定）
圖1. 通過TSA w. LTHThio contact-ICR+接觸碟和ICR Swabs取樣拭子對隔離器Neoprene手套試樣表面上的微生物檢測的操作步驟
結(jié)果和討論
使用ICR Swabs取樣拭子與ICR接觸碟在隔離器Neoprene手套表面取樣的檢測率
為確認ICR Swabs取樣拭子可以有效的檢測到Neoprene®手套表面的低水平微生物，我們將試驗中呈陽性的ICR Swabs試樣與ICR接觸碟進行了比較。如圖2所示，ICR Swabs和ICR接觸碟所呈現(xiàn)的陽性（22）樣品總數(shù)相同。
在Neoprene表面接觸碟和ICR Swabs取樣拭子的陽性試樣數(shù)量
圖2：使用ICR接觸碟和ICR Swabs取樣拭子在隔離器Neoprene®手套表面取樣的陽性樣品檢測率及接種試驗菌株的平均菌落數(shù)CFU
在接種特定試驗菌株的菌懸液樣品中，使用接觸碟都檢測到了≥5CFU的情況，ICR Swabs取樣拭子也都為陽性，如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌樣品（見表2）。在檢測大腸桿菌樣品時，接觸碟有檢測到菌落數(shù)為2CFU和1CFU的情況，而ICR Swabs取樣拭子的檢測結(jié)果為3組均顯示陽性結(jié)果。
表2：ICR接觸碟在隔離器Neoprene®手套表面取樣的微生物菌落數(shù)CFU回收率及ICR Swabs取樣拭子呈陽性的樣品數(shù)量結(jié)果
結(jié)論
本研究的結(jié)果表明，ICR Swabs取樣拭子可有效檢測隔離器Neoprene®手套表面低水平革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的微生物污染，并表現(xiàn)出可靠的生長結(jié)果。（這一段需要文本化處理）
ICR Swabs取樣拭子和我們常見的棉簽不同。
首先，它使用三層無菌包裝，且最內(nèi)層包裝可耐受VHP滅菌；
其次，采用聚酯的采樣頭，并且已使用無菌氯化鈉溶液預潤濕，采樣后在表面沒有殘留，使用后表面也無需清潔；
再次，拭子頭部預灌裝了含中和劑的TSB，采樣后折斷閥門，TSB會直接流入下面的試管，不需要再轉(zhuǎn)移拭子。
最后，按照法規(guī)的要求，A級區(qū)表面是不得檢出微生物的，ICR Swabs可對表面擦拭進行陰陽性的檢查，可有效的解決拭子采樣回收率的問題，也很好的解決了由于操作步驟復雜所帶來的假陽性的污染風險。
（這張截圖里的ICR Swab改為ICR Swab環(huán)境監(jiān)測預制培養(yǎng)基）
在日常的環(huán)境監(jiān)測中，接觸碟法和棉簽擦拭法是對藥品無菌灌裝線進行表面微生物監(jiān)測的常用方法，在現(xiàn)行的歐洲和美國GMP指南中都均有推薦和介紹，但由于取樣方法、試驗表面和測試微生物的不同，擦拭法和接觸碟取樣在微生物的回收率上會存在一些差異。
這種差異在USP <1116>中也有說明，但兩種方法都可檢測低水平的微生物污染，尤其是在A級潔凈區(qū)和隔離器中。
目前，使用隔離器進行藥品的生產(chǎn)，已成為制藥行業(yè)的一種顯著趨勢，因此對隔離器中的試驗表面進行微生物檢測是十分必要的，尤其是隔離器專用的Neoprene®手套。因此，為證明ICR Swabs取樣拭子可有效的檢測出隔離器Neoprene®手套表面的低水平微生物污染，我們進行了專門的實驗研究。
材料和方法
將Neoprene®手套試樣清潔并高壓滅菌。取4種試驗微生物在兩種不同稀釋度的菌懸液，在試樣表面接種，使其均勻分布。表1列出了所選取的試驗微生物以及接種在測試表面的菌落數(shù)CFU。革蘭氏陰性菌的接種量會更高一些，因為它們對接種表面材料的干燥過程更為敏感。
使用平板涂布法在90mm TSA平板上接種，以確定接種在試樣表面的菌落數(shù)CFU。
表1：所選取的試驗菌株和接種在100ul菌懸液中的菌落數(shù)CFU
接下來，在超凈工作臺中，我們將每個表面試樣干燥60分鐘，并用以下不同方法對干燥后的表面試樣上的試驗微生物進行3次重復檢測，操作步驟描述如下，如圖1所示。
1）接觸碟法：用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（含卵磷脂、聚山梨酯80、組氨酸和硫代硫酸鈉）對干燥表面試樣進行取樣，在測試表面均勻按壓10秒。所有平板都在30–35°C培養(yǎng)長達七天，并每日進行菌落計數(shù)。
3）棉簽擦拭法：用已預濕潤的ICR Swabs取樣拭子頭在干燥表面上小心沿水平和垂直方向擦拭取樣。隨后將ICR Swabs頂部的TSB液體培養(yǎng)基擠進拭子頭的試管中，由于干燥可能會延長微生物生長的遲緩期，所以將Swabs取樣拭子30–35°C培養(yǎng)長達七天，并每日目視檢查觀察試管的濁度情況。
培養(yǎng)長達7天并每日進行觀察（ICR接觸碟通過菌落數(shù)CFU來計數(shù)，Swabs取樣拭子通過觀察培養(yǎng)基濁度測定）
圖1. 通過TSA w. LTHThio contact-ICR+接觸碟和ICR Swabs取樣拭子對隔離器Neoprene手套試樣表面上的微生物檢測的操作步驟
結(jié)果和討論
使用ICR Swabs取樣拭子與ICR接觸碟在隔離器Neoprene手套表面取樣的檢測率
為確認ICR Swabs取樣拭子可以有效的檢測到Neoprene®手套表面的低水平微生物，我們將試驗中呈陽性的ICR Swabs試樣與ICR接觸碟進行了比較。如圖2所示，ICR Swabs和ICR接觸碟所呈現(xiàn)的陽性（22）樣品總數(shù)相同。
在Neoprene表面接觸碟和ICR Swabs取樣拭子的陽性試樣數(shù)量
圖2：使用ICR接觸碟和ICR Swabs取樣拭子在隔離器Neoprene®手套表面取樣的陽性樣品檢測率及接種試驗菌株的平均菌落數(shù)CFU
在接種特定試驗菌株的菌懸液樣品中，使用接觸碟都檢測到了≥5CFU的情況，ICR Swabs取樣拭子也都為陽性，如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌樣品（見表2）。在檢測大腸桿菌樣品時，接觸碟有檢測到菌落數(shù)為2CFU和1CFU的情況，而ICR Swabs取樣拭子的檢測結(jié)果為3組均顯示陽性結(jié)果。
表2：ICR接觸碟在隔離器Neoprene®手套表面取樣的微生物菌落數(shù)CFU回收率及ICR Swabs取樣拭子呈陽性的樣品數(shù)量結(jié)果
結(jié)論
本研究的結(jié)果表明，ICR Swabs取樣拭子可有效檢測隔離器Neoprene®手套表面低水平革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的微生物污染，并表現(xiàn)出可靠的生長結(jié)果。（這一段需要文本化處理）
ICR Swabs取樣拭子和我們常見的棉簽不同。
首先，它使用三層無菌包裝，且最內(nèi)層包裝可耐受VHP滅菌；
其次，采用聚酯的采樣頭，并且已使用無菌氯化鈉溶液預潤濕，采樣后在表面沒有殘留，使用后表面也無需清潔；
再次，拭子頭部預灌裝了含中和劑的TSB，采樣后折斷閥門，TSB會直接流入下面的試管，不需要再轉(zhuǎn)移拭子。
最后，按照法規(guī)的要求，A級區(qū)表面是不得檢出微生物的，ICR Swabs可對表面擦拭進行陰陽性的檢查，可有效的解決拭子采樣回收率的問題，也很好的解決了由于操作步驟復雜所帶來的假陽性的污染風險。
（這張截圖里的ICR Swab改為ICR Swab環(huán)境監(jiān)測預制培養(yǎng)基）
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