Inscopix神經元成像系統(tǒng)在研究專偶動物大腦中神經生物特點的應用

 
愛情在人類社會中一直是一個熱度經久不衰的話題，歷史自有記載以來就不缺乏對其的描寫。它為人類文化貢獻了極為燦爛的一部分。同其他具有個體差異的人類特點一樣，有的人專情，有的人濫情，但不同的是我們的文化有很大一部分專門對其進行了闡釋和延伸，如對禮教和家庭的，如此以來，人類的感情生活便深刻受到文化的影響。
 
通過一直以來對大腦的研究，現(xiàn)在我們相信愛情是大腦生化和電活動的一種產物。但除去人類，自然界中的各種動物對愛情生活也是差異巨大，比如部分哺乳動物是遵從一夫一妻制，部分是一夫多妻制，還有一部分是自由散漫的狀態(tài)。只有不到10％的哺乳動物（包括人類），其個體形成了基于交配的成對生活。這些動物傾向于在長時間里與伴侶一起活動并因此維持且加強了它們的情感連結。據此，我們有理由相信，生物的愛情狀態(tài)是可塑的，在它們的大腦中肯定有一些特定的編碼控制這些不同狀態(tài)的神經組織形式。
 
但它們大腦是怎樣組織這些感情以及如何影響生活的，怎樣去研究這些？在技術手段比較簡單的時期，這種研究確實很多只能停留在猜想的階段，無法探索更深層的機制�，F(xiàn)在已經有了可以大規(guī)模直觀的觀察神經元電活動的技術，使我們能夠更深層次的探索其背后的神經調控機制。
 
最近，一個研究團隊在《PNAS》上發(fā)表了的一篇文章，對這個問題嘗試進行了解答。
 
伏隔核在獎勵和動機響應中扮演的重要角色使其成為研究人員候選的編碼伴侶-獎勵通路的重點區(qū)域。在人身上，進行功能性MRI的志愿者在認為他們正握著伴侶而非陌生人的手時，他們NAc中的血氧信號會增強。在草原田鼠中，毀損這個區(qū)域的神經調節(jié)信號會損傷他們連結的形成，但接下來的基因表達會使連結得以維持。此外，在不交配的情況下，激活前額葉到NAc的神經通路足以誘導連結的形成。盡管有大量證據表明NAc在編碼伴侶連結中起主要作用，但其背后的神經機制以及它隨著關系進展如何變化仍然未解。因此，研究人員在草原田鼠交配前后，在自由活動狀態(tài)下對NAc的神經鈣活動進行了在體成像記錄，以了解大腦在連結形成、成熟時的活動變化。
 
實驗之所以采用草原田鼠，是因為它在交配上是一夫一妻制，這樣先天自然存在的專偶物種是研究感情背后生物機制的最佳研究對象，其配對測試很容易評估。
 
實驗開始，首先往實驗鼠的腦內注射鈣指示病毒，埋置微型顯微鏡，實驗時設置一個3格實驗盒，左右兩邊的格間分別拴系配偶和陌生的兩個鼠，左邊是配偶，右邊是陌生鼠，實驗動物放置起始位置是中間室，可自由進入兩邊的格間活動。實驗中，試驗動物需要在拴于格子兩端的“舊伴侶”和“陌生鼠異性”之間做出選擇。這個測試提供了一個研究固定伴侶動物的神經活動及其神經——行為關系的方法。
 
研究人員使用格羅貝爾生物的Inscopix nVista單光子微型顯微鏡，結合使用病毒載體的突觸蛋白啟動的GCaMP6f，在自由活動情況下對NAc的神經活動進行鈣活動成像（圖1A–E）。實驗一共采用了17只鼠，7雄10雌。開始在30只鼠上埋植了透鏡，其中有26只在手術后4周可見熒光。其中一部分動物因為以下原因被剔除：透鏡埋植在NAc區(qū)以外（1只），小于5個可觀測推定細胞（1只），在任何一個伴侶偏好測試中都沒有檢測到偏好性（3只），其他視野遮擋/運動偽影/技術問題（4只）。平均來說，每次記錄時每只動物能檢出43±20個細胞。ANOVA檢驗顯示，在長跨20天的3次記錄中，平均細胞數(shù)目沒有改變。對每次記錄的前60s和最后60s的每個細胞取平均ΔF/F0值，在這一階段，動物是單籠飼養(yǎng)，沒有施加刺激，得到的信號作為實驗的神經本底活動水平。在成像的每個時間點之間，得到的平均ΔF/F0值都沒有顯著差異。結合前后兩個分析點，針對每個時間點每只動物得出一個ΔF/F0本底值。
 
 
 

圖1，在一夫一妻制的草原田鼠身上進行的鈣成像實驗
 
成像期間，實驗動物的伴侶偏好明顯
 
在伴侶偏好測試中，實驗鼠會特征性的偏好選擇與單一伴侶進行互動。我們在田鼠情感連結形成的全過程中選取3個時間點進行20min伴侶偏好測試，并對其進行了鈣成像記錄。第一個時間點在田鼠尚未性成熟（day0），第二個在田鼠交配和同居短時間后（day6），第三個是田鼠交配和同居長時間后（day20）（圖1G）。如預期，幼鼠在配偶前沒有表現(xiàn)出伴侶偏好好，在配偶同居之后，顯示并增強了伴侶偏好。特別是在長期同居后，田鼠在伴侶身邊花的時間比陌生鼠更多（圖1）。相應的，它同伴侶以及陌生鼠周圍逗留的時間長度與實驗時期高度相關。交配后，田鼠在伴侶旁單詞逗留的時長也高于陌生鼠（圖1I和2A）。他們還檢查了實驗鼠分別在伴侶和陌生鼠房間逗留時與被拴田鼠的平均距離。發(fā)現(xiàn)在配偶后，實驗鼠跟伴侶鼠靠得更近（圖1J）。因此在整個互動環(huán)節(jié)，在平均社交時長和與拴系鼠的距離上，均顯示了伴侶偏好的形成。這些數(shù)據顯示長時間同居會引起更強壯的情感連結，這也引出了另一個問題：情感連結的增強是否在NAc神經活動也上有所顯示？
 
由于擔心記錄時間過短和成像記錄附著物可能會影響伴侶偏好性的檢測，因此，在同居短時間和長時間兩個點(days 7 and 21)進行成像記錄后，研究人員接著進行了常規(guī)3小時的伴侶偏好實驗。在前后兩個測試中均觀察到了伴侶偏好，還發(fā)現(xiàn)與伴侶互動時間占總時間的比例在兩個時間點是相關的，這在成像期間的實驗中沒有發(fā)現(xiàn)。與20-min測試不同，短期同居小鼠在3小時實驗中對伴侶的偏好也很明顯。這表明了常規(guī)3小時伴侶偏好實驗比前面的20分鐘實驗更敏感和穩(wěn)定，總體來說，這些數(shù)據確認了田鼠在配對和同居后對伴侶的偏好開始產生并持續(xù)增強。
 
 
 
實驗鼠在與拴系的伴侶和陌生鼠進行互動時，NAc神經元群體活動沒有改變
基于人類神經成像的研究，研究人員假設一個已經配對的田鼠在和伴侶互動時，NAc神經活動會比和陌生人互動要高很多。但在記錄全部的鈣事件后，經過對數(shù)據進行變量控制處理，數(shù)據結果并不能倒推與實驗鼠互動的是伴侶鼠還是陌生鼠。他們將實驗中持續(xù)至少1s的互動行為稱作一次社交。幼年期田鼠對兩個陌生鼠的單次社交時長沒有變化；在配對后，實驗鼠和伴侶互動的社交時長明顯比同陌生鼠的長（圖2A）。用其他計量標準衡量實驗鼠與伴侶及陌生鼠的社交時長差異（圖1H–J），也發(fā)現(xiàn)同居、配對時間越久，差異越明顯（圖2A）。
 
 

圖2，實驗鼠在情感連結建立前后，在與不同的拴系鼠進行互動的全程均有強烈的神經鈣活動
 
他們發(fā)現(xiàn)細胞群的平均鈣活動發(fā)生率在第一次社交和在單次社交的起始時比較高（圖2B–D）。田鼠在與伴侶互動時，社交時長比與陌生鼠的長（圖2A）。要弄清楚這些差異的影響，他們選擇用一個混合效應模型，因為它完美的支持多協(xié)變量并且比標準線性模型可以更魯棒的兼容結構數(shù)據。他們把單次社交時長，社交次數(shù)，及不同成像階段，針對不同鼠，性別均設立固定權值，來實驗確定哪個變量對神經活動起著最顯著的影響。發(fā)現(xiàn)NAc在社交時有強活動，但在除去社交次數(shù)和社交時長兩個變量后，發(fā)現(xiàn)實驗鼠分別與伴侶和陌生鼠互動時的平均神經活動并沒有差異。經過一系列實驗，結果發(fā)現(xiàn)，大腦NAc編碼這種情感連結的不會是神經元群的活動強弱變化。
 
 
 
“靠近細胞”群的擴張可以反映伴侶偏好的出現(xiàn)
那么是否有特定的神經元亞群可以調控田鼠的這種伴侶偏好呢？他們根據實驗鼠與伴侶或陌生鼠的靠近和離去所伴隨的神經元鈣事件響應分別推定不同功能神經元。對每個房間，計算每個鈣事件發(fā)生后的1秒內，實驗鼠與刺激鼠的距離中值（圖3A）。將觀察到的距離變化與分別在伴侶和陌生鼠房間內逗留時鈣事件隨機重復的距離變化空模型進行比較（圖3A）。通過變換給定細胞鈣事件與動物行為的綁定，打亂鈣事件與行為之間的任何統(tǒng)計關系，隨機量化事件模式的可能種類。他們在每次隨機變換事件后，統(tǒng)計距離變化中值來生成一個空分布，重復了1000次。當細胞事件響應的動物距離變化≥95%的空分布時，細胞被認為是調控“離去”行為的細胞，≤5%的空分布時則是主管“靠近”的細胞（圖3B）。因此，每個細胞都被分別分到與伴侶或陌生鼠相關的“靠近”，“離去”或“中立”組（圖3C-F）。
 
 

圖3，在連結成熟時“靠近細胞”的數(shù)量增加
 
只有在實驗中有鈣事件的細胞可能會是“靠近”或“離去”細胞。因此在統(tǒng)計“靠近”或“離去”細胞比例時用實驗中至少有一次鈣事件的細胞總數(shù)作分母。在記錄期間研究人員發(fā)現(xiàn)“靠近伴侶”細胞數(shù)量有擴增（圖3G）。幼鼠尚未配偶，腦中沒有發(fā)現(xiàn)“靠近伴侶”細胞、“靠近陌生鼠”細胞，配偶后開始出現(xiàn)兩種細胞的差異，同居長時間后變得更加明顯，正符合情感連結發(fā)展成熟過程。而長同居時，“靠近伴侶”細胞比“靠近陌生鼠”細胞的數(shù)量顯著更多。
 
研究人員也檢驗了實驗鼠分別對于伴侶和陌生鼠的“靠近”，“離去”細胞數(shù)量與實驗鼠的伴侶偏好強度是否相關。在長期同居時間點，實驗鼠伴侶偏好較強，他們發(fā)現(xiàn)對于伴侶和陌生鼠“靠近”細胞的數(shù)量與伴侶偏好強度存在顯著正相關（圖3I）。
相反，實驗鼠對于伴侶和陌生鼠的“離去”細胞數(shù)量在任何時間點都沒有差異（圖3H）。同樣，對于伴侶和陌生鼠“離去”細胞數(shù)量的差異與實驗鼠的伴侶偏好強度也沒有顯著相關性（圖3J）。
 
Inscopix的nVista™和nVoke™解決方案在世界重要刊物上已發(fā)表130+篇文章，使科學家們對大腦有了更深刻的認識，在自由移動的動物中繪制新的大腦神經回路。


 
靠近/離去細胞的活動主要發(fā)生在行為做出之前。
 
研究人員發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)靠近和離去細胞在動物發(fā)生社交接觸或離去行為之前已經表現(xiàn)出事件，這表明這些細胞可能會調控接近或離去拴系動物決策的發(fā)生。為了準確判定靠近細胞活動是否主要發(fā)生在靠近過程中或靠近行為之前，我們進行了相同的排列分析，計算了Ca2 +事件之前1 s的測試動物與刺激動物之間的距離變化，以識別發(fā)生事件的細胞。
 
靠近細胞群沒有重疊，而離去細胞群重疊。
 
實驗鼠對于伴侶和陌生鼠的靠近細胞是否屬于不同的群？研究人員進行了排序分析，并對細胞身份進行了標定以計算不同功能亞群之間潛在的分布重疊。通過與空分布進行比較，發(fā)現(xiàn)實驗鼠對伴侶和陌生鼠的“靠近”神經元重疊不大于隨機情況（圖4A），表明即使在交配/結合之前，這些細胞也可以分屬于各自不同的集合。令人驚訝的是，實驗鼠對伴侶和陌生鼠的“離去”細胞重疊大于隨機情況（圖4B）。“離去”細胞群的重疊，表明根據這種軌跡標準不能準確的定義區(qū)分“離去”細胞。
 
 

圖4，“靠近”和“離去”細胞群的特點
 
“靠近”和“離去”細胞群缺乏拓撲組織
 
根據神經細胞在解剖學上的位置分布可以一定程度上洞悉一個神經網絡的編碼行為及其信息處理方式。對于處理高階認知的網絡，已經觀察到有群集或分布式的蜂窩組織。如網格細胞在內側內嗅皮層內顯示有功能性的微組織和聚類存在。先前在NAc的研究表明，強啡肽+神經元可能存在某種空間組織，參與調節(jié)食欲和厭惡反應。因此，研究人員探究靠近和離場細胞是否在NAc內也存在某些空間組織。
 
他們在長期時間點計算了每只動物中同一身份的每個可能細胞對之間的距離，并將這些值與不符合身份分類標準的所有細胞間距進行了比較（圖4C）。發(fā)現(xiàn)陌生鼠靠近，陌生鼠離去和同伴鼠離去細胞對均與未分類細胞的間距分布無明顯差異。同伴鼠靠近細胞對的間距確實存在顯著差異，但是這些對之間的距離往往更遠而不是更近，這表明神經組織形式高度分散。為了進一步確認NAc中不存在較小規(guī)模的組織模式（例如空間隔離的簇），我們還針對給定的成像視野計算了具有相同身份的最鄰近細胞對的間距。在所有實驗鼠中，只有6.81％的最近鄰細胞對比隨機情況更近。這些結果表明，NAc中關于陌生鼠和伴侶的細胞群不是顯示聚類，而是以空間分布的模式存在。
 
研究人員在在較少數(shù)量的動物身上就獲取了大量的神經元鈣活動信息，進而通過數(shù)學方法，根據對大腦內鈣活動模式的分析，從一群細胞的鈣活動信號里分出了細胞亞群，并且找到了其亞群各自專屬的調控功能，其研究方法可圈可點。
 
（由格羅貝爾生物科技公司供稿，未經同意不得轉載）