inscopix在觀察全麻藥物激活大腦杏仁核中的中央鎮(zhèn)痛環(huán)路的應(yīng)用

 
對(duì)于全身麻醉來說，麻醉藥物一般會(huì)引起意識(shí)的喪失，同時(shí)我們也失去了痛覺感知，于是手術(shù)得以進(jìn)行。
但全身麻醉一般也會(huì)有獨(dú)立于意識(shí)喪失的鎮(zhèn)痛作用，具體實(shí)例就是正在手術(shù)的病人知曉手術(shù)室內(nèi)正在發(fā)生的事情，醫(yī)生的交談，但這種麻醉作用的潛在神經(jīng)機(jī)制還不清楚。以前，人們認(rèn)為低劑量麻醉藥物可通過阻斷脊髓背角周圍的神經(jīng)傳遞來誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用。但這種方式下，患者在沒有疼痛的同時(shí)仍能感覺到刺激，與這一想法不符。說明低劑量的麻醉鎮(zhèn)痛可能在高于脊髓的水平上起作用，從而在分離出痛覺的同時(shí)，也可以感知有害的刺激。
 
最近在《nature neuroscience》上發(fā)表的一篇文章對(duì)此進(jìn)行了研究，研究使用了時(shí)下最熱的新技術(shù)，自由動(dòng)物在體神經(jīng)元鈣成像技術(shù)，為揭示鎮(zhèn)痛之下的神經(jīng)機(jī)制提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。
下面我們來一起了解這篇研究。
 
結(jié)果
 
 
實(shí)驗(yàn)使用早期基因Fos作為最近激活的神經(jīng)元的標(biāo)志物，通過施行一個(gè)較長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)方案，觀察受刺激激活的神經(jīng)元位置，即CeA_GA中受麻醉劑激活的Fos+細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)中觀察到在麻醉劑作用下，CeA_GA中來自多個(gè)亞區(qū)域的神經(jīng)元被激活，即神經(jīng)元的多個(gè)亞群對(duì)麻醉有響應(yīng)。
使用設(shè)計(jì)的CANE方法可以準(zhǔn)確定位出受相應(yīng)麻醉藥物激活的神經(jīng)元。通過長(zhǎng)時(shí)間嚴(yán)格計(jì)劃的病毒注射，可以發(fā)現(xiàn)在小鼠大腦左右兩側(cè)的CeA_GA均有相似大小的神經(jīng)元群體，受麻醉刺激而響應(yīng)。除此之外，在使用不同麻醉藥物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同藥物引起的響應(yīng)神經(jīng)元有部分重疊。由于異氟烷可靠地誘導(dǎo)了最大數(shù)量的CeA_GA神經(jīng)元群體中的Fos+響應(yīng)，因此，在所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，研究人員將CANE與異烷麻醉結(jié)合使用以選定實(shí)驗(yàn)分析的CeA_GA神經(jīng)元。
 

   
為了了解自由移動(dòng)小鼠在麻醉劑誘導(dǎo)及其維持過程中CeA_GA神經(jīng)元的活動(dòng)，研究人員進(jìn)行了小鼠在體的鈣成像實(shí)驗(yàn)。通過設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)策略在小鼠CeA_GA神經(jīng)元中表達(dá)鈣指示劑GCaMP6m。隨后，使用高度集成的微型熒光顯微鏡并結(jié)合梯度折射率透鏡將小鼠大腦內(nèi)部的神經(jīng)元鈣活動(dòng)在顯示器上進(jìn)行直觀的觀察，將小鼠用異氟烷處理，并使用MIN1PIPE方法處理視頻數(shù)據(jù)，就這樣記錄到了這些活動(dòng)細(xì)胞的鈣動(dòng)力學(xué)變化。再次異氟醚的再次暴露激活了許多CANE-GCaMP6m捕獲的CeA_GA神經(jīng)元。為了描述活動(dòng)模式，他們根據(jù)單個(gè)神經(jīng)元平均熒光的比率對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行了排序。分析表明，在異氟烷處理期間，有89.7％的成像神經(jīng)元顯示熒光增強(qiáng)。
通過對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)在之前實(shí)驗(yàn)中使用基于Fos的CANE方法選定的CeA_GA都會(huì)被異氟烷重新激活，并且也會(huì)大量被其他麻醉劑激活，這些體內(nèi)成像結(jié)果有力地支持了可被異氟烷和氯胺酮麻醉作用激活的CeA_GA神經(jīng)元并集的存在。
 

   
通過光遺傳方法對(duì)小鼠大腦內(nèi)的特定神經(jīng)元進(jìn)行激活或抑制，可以研究特定神經(jīng)元的具體功能。在該研究中，實(shí)驗(yàn)人員通過在小鼠大腦特定神經(jīng)元上表達(dá)興奮性或抑制性受體，并結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠在給藥前后對(duì)痛覺刺激的反射行為有什么變化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種痛覺刺激，分別是冷，熱，針刺激，分別作用在野生型小鼠和急性痛覺模型小鼠身上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在激活CeA_GA神經(jīng)元后，小鼠對(duì)痛覺的敏感度下降，光抑制之后，敏感度上升。小鼠對(duì)傷害性刺激的條件反射行為受到了影響。
除了直接的撤離或防御行為外，急性疼痛還會(huì)引起動(dòng)物自身的照顧行為，就比如人手被燙傷后會(huì)立刻往受傷部位吹氣一樣。在對(duì)小鼠的這一行為進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，光遺傳刺激CeA_GA的神經(jīng)元也會(huì)顯著影響這種自我保護(hù)性照顧行為。
 

   
CeA_GA神經(jīng)元的光遺傳抑制使CeA_GA-eArch小鼠對(duì)機(jī)械，熱和冷刺激高度敏感，并加劇了疼痛引起的關(guān)懷行為，這使得研究人員思考CeA_GA神經(jīng)元的基礎(chǔ)活動(dòng)水平以超敏行為起到預(yù)防刺激的可能性。換句話說，短期的有害刺激是否會(huì)改變正常小鼠的CeA_GA神經(jīng)元自發(fā)水平的活動(dòng)。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CeA_GA神經(jīng)元的活性并沒有對(duì)施加的刺激有明顯受影響的跡象，細(xì)胞群體行為表現(xiàn)平穩(wěn)。在對(duì)單個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)在受到刺激后并不會(huì)改變其基礎(chǔ)活動(dòng)水平，與群體表現(xiàn)一致，表明CeA_GA神經(jīng)元可能在很大程度上呈現(xiàn)的是動(dòng)物內(nèi)部狀態(tài)，而不是短期的有害刺激。
 

   
下一個(gè)關(guān)鍵問題是激活CeA_GA神經(jīng)元是否可以抑制慢性神經(jīng)性疼痛下的機(jī)械性超敏反應(yīng)。他們用CeA_GA-GFP和CeA_GA-ChR2小鼠制作了慢性口面神經(jīng)性疼痛模型，其中將眶下神經(jīng)結(jié)扎在面部右側(cè)，即為慢性阻塞損傷（CCI）。這種傷害導(dǎo)致IoN連接側(cè)的胡須墊處對(duì)非有害觸覺刺激持續(xù)敏感。在沒有光刺激的面部von Frey試驗(yàn)中，CCI-IoN小鼠開始表現(xiàn)出對(duì)兩側(cè)正常無害的0.02 g力有退縮反應(yīng)。這與已知的由神經(jīng)性疼痛引起的機(jī)械性超敏反應(yīng)或異常疼痛相一致，包括未受傷一側(cè)的鏡像疼痛。值得注意的是，單側(cè)ChR2激活CeA_GA神經(jīng)元會(huì)極大地減少受傷側(cè)的撤離反應(yīng)，甚至對(duì)1.0 g刺激都沒有反應(yīng)，而對(duì)照組實(shí)驗(yàn)并沒有改變其敏感性。同時(shí)注意，在未受傷害的狀態(tài)和未受傷害的一側(cè)，即使通過ChR2激活CeA_GA神經(jīng)元，1.0 g von Frey刺激施加于面部也會(huì)引起退縮反射。相比之下，在CCI-IoN小鼠身上，CeA_GA的激活表明受傷一側(cè)在響應(yīng)1.0 g時(shí)受損，說明神經(jīng)性疼痛下的機(jī)械性超敏反應(yīng)主要是由異常的中央加工引起的。
 
研究人員還在CCI-IoN動(dòng)物中進(jìn)行了條件位置偏好實(shí)驗(yàn)（CPP）。 光激活CeA_GA-ChR2小鼠的CeA_GA神經(jīng)元產(chǎn)生對(duì)光激活腔室的位置偏好記憶，而對(duì)照組CeA_GA-GFP小鼠不會(huì)，大概是由于該位置疼痛緩解。此外，CCI-IoN動(dòng)物表現(xiàn)出自發(fā)性不對(duì)稱地擦拭受傷側(cè)，說明它們感受到自發(fā)性疼痛。 CeA_GA-ChR2小鼠中CeA_GA神經(jīng)元的ChR2激活顯著減少了CCI-IoN小鼠的總擦拭時(shí)間，并且在刺激后期也具有持久作用。綜上所述，CeA_GA神經(jīng)元的激活可有效抑制慢性神經(jīng)性疼痛模型中與疼痛有關(guān)的行為。
 

 
圖5，在慢性阻塞物損傷模型鼠中的CeA_GA神經(jīng)元激活強(qiáng)烈降低了傷害感受相關(guān)行為，并驅(qū)動(dòng)了條件位置偏好。
 
研究人員對(duì)CeA_GA投射出來的神經(jīng)元進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)它投射到大腦中非常廣泛的區(qū)域。分析投射目標(biāo)區(qū)域，研究人員注意到，許多CeA_GA神經(jīng)元的軸突靶標(biāo)含有福爾馬林疼痛誘導(dǎo)的Fos +神經(jīng)元。考慮到CeA_GA神經(jīng)元是GABA能的，原則上它們處于通過其投射有效抑制這些疼痛激活神經(jīng)元活動(dòng)的理想位置。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接受雙向光遺傳激活CeA_GA區(qū)域的CeA_GA-ChR2小鼠在所有投射目標(biāo)區(qū)域均顯示出Fos+神經(jīng)元數(shù)量的明顯減少。因此，CeA_GA神經(jīng)元可以有效抑制大腦中許多疼痛處理中心的神經(jīng)激活。
 

   
研究開始研究人員假設(shè)全麻的鎮(zhèn)痛作用與麻醉引起的意識(shí)喪失是分開的，尤其在低麻醉藥物濃度下。而在對(duì)由1.5％異氟烷捕獲的CANEISO-GCaMP6m神經(jīng)元進(jìn)行在體成像時(shí)，也確實(shí)發(fā)現(xiàn)在0.5％異氟烷下，更多的神經(jīng)元被持續(xù)激活。為了準(zhǔn)確考察劑量效應(yīng)，研究人員轉(zhuǎn)而使用小劑量的氯胺酮，這在臨床上具有鎮(zhèn)痛作用。之前的研究表明，氯胺酮在12 mg/kg時(shí)對(duì)小鼠有鎮(zhèn)痛效果。在三個(gè)成像實(shí)驗(yàn)（1.5％異氟烷，常規(guī)劑量的氯胺酮和低劑量的氯胺酮）中得到的結(jié)果表明，大多數(shù)被跟蹤觀察的神經(jīng)元在所有三種情況下均被激活，包括低劑量氯胺酮。
 
為了測(cè)試低劑量氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用是否需要CeA_GA神經(jīng)元的活性，研究人員對(duì)光遺傳抑制小鼠進(jìn)行了辣椒素試驗(yàn)。在辣椒素注入鼠爪后，鹽水組引起了強(qiáng)有力的爪舔。小劑量氯胺酮?jiǎng)t可顯著減少舔舐時(shí)間。值得注意的是，當(dāng)CeA_GA神經(jīng)元在辣椒素+氯胺酮條件下被光遺傳抑制時(shí)，小鼠舔爪的時(shí)間與辣椒素+氯胺酮條件下的時(shí)間相似，此時(shí)氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用被阻礙了。該結(jié)果表明，CeA_GA神經(jīng)元的活性是小劑量氯胺酮緩解疼痛的作用所必需的。
 

 
圖7，對(duì)于所有CeA_GA的目標(biāo)區(qū)域，CeA_GA神經(jīng)元的激活降低了福爾馬林所誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性，而抑制的CeA_GA神經(jīng)元?jiǎng)t阻礙了低劑量氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用。
 
CeA以前曾被認(rèn)為是應(yīng)激和安慰劑誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，CeA的損傷會(huì)損害其鎮(zhèn)痛作用。
 
目前還不知道全身麻醉藥如何誘導(dǎo)CeA_GA神經(jīng)元的瞬時(shí)或持續(xù)活化，也不知道持續(xù)激活CeA_GA神經(jīng)元是否會(huì)上癮。但這項(xiàng)工作提出了利用這種內(nèi)源性止痛系統(tǒng)緩解慢性疼痛的令人興奮的可能性。可以給發(fā)展下一代不含鎮(zhèn)靜作用的止痛藥留一些啟示。
 
（由格羅貝爾生物科技公司供稿，未經(jīng)同意不得轉(zhuǎn)載）