顯微技術(shù)在病毒與傳染病學(xué)研究中的應(yīng)用

傳染�。↖nfectious Diseases）是由各種病原體引起的能在人與人、動物與動物或人與動物之間相互傳播的一類疾病。中國目前的法定報(bào)告?zhèn)魅静》譃榧住⒁�、�?類，共40種。此外，還包括國家衛(wèi)生計(jì)生委決定列入乙類、丙類傳染病管理的其他傳染病和按照甲類管理開展應(yīng)急監(jiān)測報(bào)告的其他傳染病。新型冠狀病毒肺炎雖然納入乙類傳染病，但仍采取甲類管理措施。
 
中國法定傳染病分類

類別	病種
甲類	鼠疫、霍亂
乙類	新型冠狀病毒肺炎、布魯氏菌病、艾滋病、狂犬病、結(jié)核病、百日咳、炭疽、病毒性肝炎、革登熱、新生兒破傷風(fēng)、流行性乙型腦炎、人感染H7N9禽流感、血吸蟲病、鉤端螺旋體病、梅毒、淋病、猩紅熱、流行性脊髓膜炎、傷寒和副傷寒、瘧疾、流行性出血熱、麻疹、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、傳染性非典型肺炎
丙類	感染性腹瀉病、絲蟲病、麻風(fēng)病、黑熱病、包蟲病、流行性和地方斑疹傷寒、急性出血性結(jié)膜炎、風(fēng)疹、流行性腮腺炎、流行性感冒、手足口病
其他	寨卡病毒、鼻疽和類鼻疽、人獸共患病、基孔肯亞熱、廣州管圓線蟲病、阿米巴性痢疾、人豬重癥鏈球菌感染、德國腸出血性大腸桿菌O104感染、美洲錐蟲病、諾如病毒急性腸炎、鄂口線蟲病、西尼羅病毒、馬爾堡出血熱、拉沙熱、黃熱病、裂谷熱、埃博拉出血熱、中東呼吸綜合征、埃可病毒11型

數(shù)據(jù)來源：中國疾病預(yù)防控制中心
 
引起這些傳染病的病原體中微生物占絕大多數(shù)，包括病毒、衣原體、立克次體、支原體、細(xì)菌、螺旋體和真菌，另外一小部分是寄生蟲。

數(shù)據(jù)來源：中國疾病預(yù)防控制中心
 
歷史上，病毒引發(fā)的疫情在全球各地造成了恐慌和浩劫。流感、天花、麻疹和黃熱病的影響持續(xù)了幾個世紀(jì)，給經(jīng)濟(jì)造成巨大負(fù)擔(dān)。21世紀(jì)多起高致病性、高傳染性的人獸共患病暴發(fā)，包括非典型肺炎病毒(SARS-CoV)、埃博拉病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)、尼帕病毒和年初爆發(fā)的2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）。
 
其中天花被認(rèn)為是人類最具毀滅性的疾病之一。它在人群中的傳播，可能是由動物宿主傳播幾千年之后，伴隨著地區(qū)和大陸間的人口流動、貿(mào)易和戰(zhàn)爭才開始的。這種古老的疾病，至少可以追溯到公元前三世紀(jì)。從古至今，天花影響了過去社會的各個階層，包括著名的順治皇帝。自200多年前天花疫苗的研制，經(jīng)過密集的疫苗接種后，該病在1980年被正式宣布消滅。
 
相似的，近期一項(xiàng)針對新冠病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析在S蛋白進(jìn)化角度顯示，新冠病毒可能已經(jīng)在人群中進(jìn)化了至少7年。之前的研究證實(shí)，新冠病毒與蝙蝠冠狀病毒（RaTG13）基因組相似度為96%，與穿山甲-CoV基因組相似度為90%。為了確定具體驅(qū)動其最近適應(yīng)人類宿主的重要突變，研究人員重建了所有感染人類的病毒株的共同祖先Spike-RBD序列，稱為N1，將與其最接近的動物病毒RaTG13的共同祖先標(biāo)記為N0。N1與新冠參考序列中的Spike-RBD相同，而N0的Spike-RBD序列是唯一的，兩者在4個位點(diǎn)上的變化將進(jìn)化的新冠病毒Spike蛋白與和RaTG13的共同祖先區(qū)分開來，而這個祖先病毒至少在2013年就已經(jīng)存在（其后代RaTG13在那一年被分離出來）。意外的是，N0變?yōu)镹1降低了Spike-RBD與ACE2受體的親和力，可是為什么最近才演變成重大公共衛(wèi)生問題，這種潛在的流行又該如何被發(fā)現(xiàn)并預(yù)防？

顯微鏡下觀察到的病毒示意圖
目前條件下，對病毒暴發(fā)的長期控制需要使用疫苗，以提供免疫耐受和保護(hù)。流行病發(fā)生后，對特定疾病建立的免疫力可以限制傳播并顯著降低死亡率。
過去，疫苗的接種大大減輕了世界各地傳染病的負(fù)擔(dān)，包括控制了脊髓灰質(zhì)炎、破傷風(fēng)、白喉和麻疹等疾病。大量的研究工作集中在改進(jìn)已有疫苗和發(fā)現(xiàn)新疫苗，例如2006年的HPV疫苗。近年來，新冠病毒、寨卡病毒等嚴(yán)重感染的迅速蔓延突出了全球預(yù)防大流行病的迫切需求，這就需要極其迅速地研制和全面普及疫苗，以預(yù)防可能未知的病原體。并且抗生素耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)也需要新方法來預(yù)防感染。鑒于這些變化，確定新候選疫苗的現(xiàn)有方法已不足以保證大規(guī)模防護(hù)。
 
而治療性抗體也在短期預(yù)防和被動免疫治療中發(fā)揮出重要作用，通過中和病毒，殺傷感染細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫等機(jī)制達(dá)到治療目的。其中，聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(cART)在控制HIV復(fù)制和傳播方面的效果使其得到普遍推薦。
 
然而，快速治療、高效預(yù)防、精準(zhǔn)溯源等的研究，都需要以快速的鑒定并全面認(rèn)識病原微生物為基石。
 
1884年，Robert Koch在肺結(jié)核研究中提出了科赫法則的雛形。同年，F(xiàn)riedrich Loffler將其發(fā)揚(yáng)光大，寫下了著名的分離、培養(yǎng)和接種三步法，作為確定病原體存在的條件。這一理論的本質(zhì)是疾病本體論，即建立人類疾病動物模型具有實(shí)際意義。
依據(jù)科赫法則鑒定傳染病的病原體流程
 
100多年來，科赫法則一直指導(dǎo)著微生物學(xué)研究，以鑒定傳染病的病原體，常常提供可靠的證據(jù)。后來這些法則被病毒學(xué)及分子醫(yī)學(xué)方向的研究人員引用，將自己的研究與科赫的細(xì)菌學(xué)聯(lián)系起來，演變?yōu)闄?quán)威實(shí)踐指南，證明微生物及后來的基因在疾病中的作用，是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的起源。
 
20世紀(jì)隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，人們開始對病毒形態(tài)學(xué)產(chǎn)生認(rèn)識。30年代末電子顯微鏡的出現(xiàn)，標(biāo)志著病毒學(xué)的另一項(xiàng)技術(shù)突破，其在病毒鑒別診斷、抗原的定位、病毒-宿主細(xì)胞互作以及病毒形態(tài)發(fā)生學(xué)的研究中扮演著重要角色，當(dāng)然這些認(rèn)識是以臨床數(shù)據(jù)及光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡為基礎(chǔ)的。由于受到光學(xué)衍射的限制，普通顯微鏡分辨率只能達(dá)到200nm，而一般病毒的尺寸只有十幾到200納米（痘病毒達(dá)300nm），而電鏡卻以其高昂的價格讓諸多病毒研究愛好者研究受限。超高分辨顯微技術(shù)的出現(xiàn)，為觀測精細(xì)結(jié)構(gòu)提供了可能，因此在病毒研究中的應(yīng)用越來越廣泛。隨著科學(xué)的進(jìn)展，關(guān)于病毒的研究技術(shù)也不再僅限于傳統(tǒng)的病毒分離與血清學(xué)，還包括后期出現(xiàn)的分子方法等等。
超高分辨共聚焦顯微鏡廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代病毒研究
 
時至今日，科學(xué)家對病毒研究熱情不減。PebMed數(shù)據(jù)庫中，病毒相關(guān)研究數(shù)量逐年走高，重點(diǎn)研究集中在疫苗、抗體、病毒作用機(jī)制等基礎(chǔ)生命科學(xué)，同時包括臨床診斷及流行病學(xué)研究等，但最大占比仍為病毒本身的研究。近日公布的國家自然科學(xué)基金數(shù)據(jù)顯示，批復(fù)的新冠疫情專項(xiàng)課題共110項(xiàng)，總資金近億元。國家對公共衛(wèi)生服務(wù)與傳染病防控投入逐年加大，熱點(diǎn)研究背景有了宏觀政策的加持，論文發(fā)表呈“井噴式”增長，研究結(jié)果不斷推陳出新。

數(shù)據(jù)來源：PebMed.gov
（截止時間：2020年6月30日）
 
 
寫在最后的話：
“如果有什么東西在未來幾十年里可以殺掉上千萬人，比較有可能是個高度傳染的病毒，而不是戰(zhàn)爭。也不是導(dǎo)彈，而是微生物。一部分原因是我們在核威懾上投入了很大的精力和金錢，但在防止疫情的系統(tǒng)上卻投資很少。我們還沒有準(zhǔn)備好預(yù)防下一場大疫情的發(fā)生。”
——比爾·蓋茨
 
 
參考文獻(xiàn)：

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4. Volume 42, April 2018, Pages 47-52
5. Microbiol Spectr. 2016 Aug;4(4)
6. Viruses . 2020 Apr 20;12(4):465
7. doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.22.165787
8. https://courses.lumenlearning.com/
9. https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/applications/life-science/