Ella Simple ELisa檢測(cè)技術(shù)在宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP）殘留的應(yīng)用
宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP）殘留，是重組治療性蛋白質(zhì)、重組疫苗及重組抗體藥物工藝過程中產(chǎn)生的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其修飾體。
HCP殘留是工藝穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，是重組疫苗及重組抗體類藥物的重要質(zhì)控指標(biāo)，ELISA法是各國藥典推薦方法。美國FDA推薦值：1-100ppm（ppm：百萬分之一），中國藥典重組疫苗個(gè)論，CHO細(xì)胞HCP小于0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）。--HCP的來源--
※與宿主細(xì)胞相關(guān)※
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生的與先天免疫（Toll樣受體）相關(guān)的鞭毛蛋白
Toll樣受體（TLR）是先天免疫系統(tǒng)的一部分，在哺乳動(dòng)物之間高度保守。它們已進(jìn)化為對(duì)外來病原體，尤其是細(xì)菌，提供一線反應(yīng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。鞭毛蛋白（一種常見的蛋白質(zhì)）大量存在于所有鞭毛細(xì)菌中，包括用于生產(chǎn)重組生物治療藥物的大腸桿菌之中。鞭毛蛋白具有較強(qiáng)的抗原性，可以與人類Toll樣受體中的TLR5結(jié)合，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。因此，宿主細(xì)胞產(chǎn)生的HCP如鞭毛蛋白，可作為免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗HCP抗體，所以需在質(zhì)量控制時(shí)進(jìn)行監(jiān)控（因觸發(fā)TLR可能引起敗血性休克）。
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生的酶類
宿主細(xì)胞產(chǎn)生的活性酶，例如組織蛋白酶D，可以與mAb中的特定序列結(jié)合，從而使抗體降解。其它由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的溶酶體磷脂酶A2和纖維素酶可以直接影響賦形劑的穩(wěn)定性，從而影響產(chǎn)品制劑的穩(wěn)定性。
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子雜質(zhì)
細(xì)胞因子是一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子一般通過結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和效應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答。高度保守的細(xì)胞因子，也可在宿主細(xì)胞中表達(dá)。如宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如MCP-1或TGF-β1，在產(chǎn)品純化中未能達(dá)到很好監(jiān)控，則臨床上易發(fā)生患者組胺釋放等不良反應(yīng)事件。
※與產(chǎn)品相關(guān)※
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)品的同源物
宿主細(xì)胞產(chǎn)生與產(chǎn)品同源的HCP產(chǎn)物，例如在對(duì)早期生物藥物之一重組人組織纖溶酶原激活劑（tPA，Activase，Genentech）進(jìn)行表征的過程中，觀察到一個(gè)較小的變異。進(jìn)一步的研究表明，這是從用于生產(chǎn)該產(chǎn)品的CHO細(xì)胞中共純化倉鼠纖溶酶原激活劑（PA）。且兩種蛋白之間存在大約80％的同源性。如果HCP是產(chǎn)品的同源物，并且可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，則會(huì)具有相似的色譜特性，從而實(shí)現(xiàn)共純化。但在臨床試驗(yàn)期間安全性數(shù)據(jù)表明，即使含有PA這種HCP，該藥物總體上的風(fēng)險(xiǎn)水平是可接受的。但由于對(duì)于大多數(shù)治療適應(yīng)癥（中風(fēng)，心肌梗塞，肺栓塞）的患者，tPA是單次靜脈注射，因此容易導(dǎo)致雜質(zhì)的免疫原性。
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)品靶點(diǎn)的同源物
如果宿主細(xì)胞產(chǎn)生的人源化或人單克隆抗體（mAb）可以與目標(biāo)蛋白的倉鼠同源物發(fā)生反應(yīng)，那么這種HCP會(huì)將通過純化系統(tǒng)進(jìn)行攜帶。例如AntigenA是一種與目標(biāo)疾病有關(guān)的肽，它在物種之間是高度保守的，因此會(huì)在CHO系統(tǒng)表達(dá)。當(dāng)mAb與AntigenA特異性結(jié)合后，mAb會(huì)將此類蛋白質(zhì)帶入最終產(chǎn)物。雖然此類HCP可以通過下游處理在某種程度上清除。盡管如此，生物制藥生產(chǎn)商應(yīng)了解其靶蛋白的宿主細(xì)胞同源物，并設(shè)計(jì)純化和控制系統(tǒng)來解決此問題。
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宿主細(xì)胞產(chǎn)生與產(chǎn)品非特異性結(jié)合的HCP
--HCP帶來的影響--
※免疫原性※
HCP在患者中可能具有直接的生物學(xué)活性，例如觸發(fā)Toll-Like受體介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，或者直接由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子刺激機(jī)體，產(chǎn)生組胺，發(fā)生炎癥反應(yīng)。對(duì)于一些與產(chǎn)品非特異性結(jié)合的HCP，則可直接在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抗體，增加病人體內(nèi)的抗體滴度。
※佐劑效應(yīng)※
HCP可以是免疫原性的，直接引發(fā)針對(duì)特定HCP雜質(zhì)的抗體。但同時(shí)也可以作為佐劑，從而增加機(jī)體對(duì)治療蛋白的免疫反應(yīng)，及產(chǎn)生抗抗體“ADA”，從而直接影響藥物在生物分布，藥代動(dòng)力學(xué)和生物活性。
※產(chǎn)品穩(wěn)定性※
HCP雜質(zhì)同樣會(huì)影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性，從而影響生物藥物的使用。例如宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白酶，直接與某些抗體的降解有關(guān)。也有研究報(bào)道，一些由CHO或大腸桿菌衍生的HCP可以影響賦形劑聚山梨酯20和聚山梨酯80的穩(wěn)定性，從而影響藥物的儲(chǔ)存。
--CHO HCP的檢測(cè)方法--
中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞被廣泛用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)。在這些蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程中，宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP），被作為來自過程中的相關(guān)雜質(zhì)而被共純化，對(duì)接受治療性蛋白的患者造成潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。因此，在生物制藥藥物開發(fā)中，需要監(jiān)測(cè)與過程相關(guān)的HCP的含量。監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求最終藥品中的HCP含量必須小于100 ppm，但仍需藥物生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)方法以量化IP（in-process）和最終原料藥DS（drug substance）中的HCP含量，以證明HCP清除率。
ELISA是在1970年代開發(fā)的，利用抗體在96或384孔微孔板中定量感興趣的特定抗原。 ELISA有多種類型，例如直接，間接，三明治和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。在所有類型中，檢測(cè)都取決于抗體和抗原的結(jié)合方式。通常，雙抗體夾心ELISA用于定量HCP。
但是，傳統(tǒng)Elisa檢測(cè)HCP具有以下缺點(diǎn)：
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多次手動(dòng)操作（即緩沖液，洗滌步驟，抗體和抗原添加，樣品添加，孵育步驟）；
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需要優(yōu)化緩沖液，以使“捕獲”抗體與微孔板的連接穩(wěn)定。否則，它將無法捕獲樣品，從而導(dǎo)致檢測(cè)和比色響應(yīng)不足；
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試劑孵育長或短時(shí)間可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果，因此需要考慮板的顯影時(shí)間；
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操作時(shí)間長，一般為5-7小時(shí)；
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樣品上樣量大，需要100-200μl。
--Ella CHO HCP檢測(cè)--
Ella CHO HCP 3G使用微流體代替板清洗和加載步驟來測(cè)量抗原濃度（圖1A）。所有實(shí)驗(yàn)性免疫測(cè)定步驟均在精心設(shè)計(jì)的帶有三個(gè)單獨(dú)的玻璃納米反應(yīng)器（GNR）的單個(gè)通道中進(jìn)行。捕獲抗體固定在GNR上，而抗原樣品和檢測(cè)抗體（生物素化抗體和SA-dyelite650）都從特定的入口通道流到GNR（圖1B）。
全程Ella分析只需三個(gè)步驟：
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向孔中添加25μl樣品；
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將Cartridge放入Ella儀器中進(jìn)行全自動(dòng)的樣品上樣；
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Ella自動(dòng)抗體孵育及檢測(cè)。
在每個(gè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行結(jié)束時(shí)，每個(gè)樣品有三個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)，分別對(duì)應(yīng)于每個(gè)孔中的三個(gè)GNR。所有孵育均在一個(gè)步驟中進(jìn)行（傳統(tǒng)ELISA需對(duì)單個(gè)樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)有多種操作）。此外，可以將標(biāo)準(zhǔn)曲線以“條形碼”的形式內(nèi)置到Ella里，無需再做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Ella CHO HCP與Elisa檢測(cè)HCP清除率的可比性研究
Ella CHO HCP與Elisa檢測(cè)多個(gè)抗體HCP的精密度的可比性研究
Ella CHO HCP與Elisa檢測(cè)多個(gè)抗體HCP的準(zhǔn)確性的可比性研究
總結(jié)：
Ella CHO HCP檢測(cè)可以在IP開發(fā)為DS期間，加快對(duì)CHO HCP雜質(zhì)進(jìn)行與開發(fā)相關(guān)決策的速度。Ella的軟件支持GMP，并且可以在GMP實(shí)驗(yàn)室中建立。Ella只需75分鐘的分析時(shí)間，可以加速藥品的批量釋放。此外，Ella還擁有多因子檢測(cè)的能力，可以將CHO HCP和這些共純化的HCP（具有免疫原性或穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)的酶類）都可以在一個(gè)測(cè)定板上同時(shí)進(jìn)行分析。
參考文獻(xiàn): Experience with Host Cell Protein Impurities in Biopharmaceuticals,Biotechnol Prog. 2018 Jul;34(4):828-837.
