2020版藥典解讀四-生物毒素類污染殘留的操作與變化
致分析工作者
普瑞邦自成立以來，始終堅(jiān)持誠信、協(xié)作、創(chuàng)新、發(fā)展的價(jià)值觀，肩負(fù)立足創(chuàng)新，以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品賦檢測于精準(zhǔn)，以創(chuàng)新技術(shù)推進(jìn)檢測技術(shù)進(jìn)步的使命，專注于真菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)。繼2017年全自動(dòng)免疫親和柱操作儀推出之后，2018年年初普瑞邦（青島）技術(shù)中心在國內(nèi)率先推出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的展青霉素、嘔吐毒素、環(huán)匹阿尼酸、黃曲霉素等一系列13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，成為全球第二家擁有自主研發(fā)生產(chǎn)真菌毒素13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的供應(yīng)商。產(chǎn)品線涵蓋真菌毒素固/液標(biāo)準(zhǔn)品、13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控樣品、前處理凈化柱(多功能凈化柱和免疫親和柱、分子印跡柱) 、酶聯(lián)免疫試劑盒、檢測卡以及樣品前處理自動(dòng)化儀器（全自動(dòng)免疫親和柱操作儀、自動(dòng)化均質(zhì)器、自動(dòng)配標(biāo)儀），光/電化學(xué)類衍生器等設(shè)備。也提供維生素、抗生素、過敏原檢測、轉(zhuǎn)基因檢測和食品酶法分析試劑盒等多類產(chǎn)品。
我們不僅承諾為您提供質(zhì)量可靠、穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的色譜耗材和儀器，同時(shí)保證售前、售中和售后完備的產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)。
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目 錄
一、 2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法
二、 2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀
三、 SN/T 4604-2016進(jìn)出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）
四、 復(fù)雜中藥材樣品測定解決方案
五、 Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定
六、 中藥材黃曲霉毒素測定采購指南
七、 中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例
本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
1. 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑
2. 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）
3. 采用柱后衍生器檢測
4. ①碘衍生法：衍生溶液為0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀釋至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃；②光化學(xué)柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化學(xué)柱后衍生器.Pribolab-MDU光化學(xué)柱后衍生器）
5. 熒光檢測器檢測，激發(fā)波長：360nm(365nm) 發(fā)射波長：450nm
6. 兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。
（二）混合對照品溶液的制備
精密量取PriboFast ® STD#1082AFT黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。
（三）供試品溶液的制備
1. 取供試品粉末約15g(過二號篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度大于11,000 r/min,普瑞邦均質(zhì)器Pribolab® WR800: 轉(zhuǎn)速22,000 r/min）。
2. 4000r/min離心5分鐘。
3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（專用淋洗緩沖液）稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min）
4. 準(zhǔn)確移取20.0mL樣品提取液，過PriboFast® 免疫親和柱，過柱時(shí)流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。
5. 用水20mL洗脫（必要時(shí)可先用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗滌液棄去。
6. 為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進(jìn)行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當(dāng)溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進(jìn)行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(免疫親和柱操作建議使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各個(gè)步驟流速,保證較好的回收率)
7. 測定法：分別精密吸取上述混合對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。
第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
以十八烷基硅烷鍵硅膠填充劑；以10mmol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B；柱溫25℃；流速0.3mL/min；按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。
精密量取黃曲霉毒素混對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含黃曲霉毒素B2、G2濃度為0.04〜3ng/mL，黃曲霉毒素B1、G1濃度為0.12〜l0ng/mL的系列對照品溶液，即得（必要時(shí)根據(jù)樣品實(shí)際情況，制系列基質(zhì)對照品溶液）
（三）供試品溶液的制備同第一法
測定法精密吸取上述系列對照品溶液各5μL,注入高效液相色譜-質(zhì)譜，測定峰面積，以峰面積縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)。另精密吸取上述供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。
第三法 酶聯(lián)免疫法
本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1，或黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
精密量取 PriboFast®STD#1041黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，PriboFast®STD#1082AFT黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用硫酸鹽緩沖液稀釋成每1L含0 µg、0.05 µg、0.15 µg、0.45 µg、1.35 µg（測定黃曲霉毒素B1）或0 µg、0.025 µg、0.075 µg、0.225 µg、0.675 µg（測定黃曲霉毒素總量）的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即得。
（二）供試品溶液的制備
1. 供試品粉末2.0g至50mL離心管中，20mL甲醇振蕩5min，離心5min（3000r/min）。
2. 取2mL上清液至10mL干凈離心管中，50-60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈伞?br /> 3. 加入2mL去離子水振動(dòng)30秒，加入6mL三氯甲烷振蕩2min，離心5min（3000r/min）。
4. 取下層三氯甲烷液3-10mL于離心管中，置氮吹儀于50-60℃水浴濃縮至干，加入1mL正己烷渦旋30秒，再加入2mL磷酸鹽緩沖液渦旋1min，離心5min（3000r/min），取下層液，即得。
（三）測定法
黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素總量的測定：分別采用合適濃度的抗體包被微孔板孔，經(jīng)封閉、干燥等處理后加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入經(jīng)酶標(biāo)抗原稀釋液稀釋至合適工作濃度的酶標(biāo)抗原，混勻，于25℃反應(yīng)45min，用洗滌工作液洗滌，每孔加入底物顯色液100μL，于25℃反應(yīng)15min，每孔加入終止液50μL，采用酶標(biāo)儀于450nm處，參比波長630nm，測定每孔吸光度值。
注：
（1）測定前，可選擇陰性樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，樣本回收率應(yīng)在60%-120%。
（2）線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990。
（3）供試品溶液百分吸光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時(shí)，須對已制備好的供試品溶液進(jìn)行稀釋，使其百分吸光率落入曲線范圍后再檢測。
（4）當(dāng)測定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。
【附注】
1. 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。
2. 殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口中藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口當(dāng)歸、桔梗五味子、枸杞、大青葉、金銀花、地龍中黃曲霉素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
2. 分析步驟
(1) 提取
稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘?jiān)屑尤?5 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。
(2) 免疫親和柱凈化
稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5 000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘?jiān)屑尤?5 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。
將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下,將50 mL提取液B全部通過免疫親和柱(PriboFast®復(fù)合免疫親和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐溫的PBS淋洗親和柱，再將5mL提取液A通過免疫親和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通過親和柱，用5mL含0.1%吐溫的PBS和20mL水淋洗親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱，棄去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，當(dāng)甲醇大部分過柱時(shí)，停止加壓，靜置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；將淋洗液置于40℃下水浴氮?dú)獯蹈�，�? mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(40：60體積比)溶解殘?jiān)�，過0.22 μm有機(jī)系濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。
黃曲霉毒素B、G混標(biāo)
表1：精密度與回收率比對表
表2：成本及操作比對表
Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀在進(jìn)行過免疫親和柱實(shí)驗(yàn)中得到了優(yōu)于手動(dòng)過柱的結(jié)果，通過比對不難發(fā)現(xiàn)，Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀在回收率和精密度方面有所提高，大大節(jié)省了人力以及時(shí)間成本，同時(shí)也縮短了實(shí)驗(yàn)人員接觸試劑的時(shí)間，最大程度地保證了實(shí)驗(yàn)人員的安全。
2. 部分中藥材前處理不干凈，液相雜峰多
3. 樣品中峰的定性判斷
4. 遠(yuǎn)志、檳郎等過柱困難的樣品處理
5. 液相色譜峰拖尾或前沿
6. 色譜柱如何維護(hù)
7. 標(biāo)準(zhǔn)品的保存與分解
8. 樣品加標(biāo)回收的方法
9. 曲線線性不好
10. 基線不平，噪音大
注：如有問題請與我們聯(lián)系！
此文件僅供參考，具體內(nèi)容以2020版藥典為準(zhǔn)。
本文件中的信息，如有改變，恕不另行通知。
青島普瑞邦生物工程有限公司
關(guān)于Pribolab:
Pribolab成立于2008年，專注于食品安全（尤其生物毒素）檢測產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用。經(jīng)過十多年的發(fā)展，公司已成為集產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)用、生產(chǎn)銷售、檢測技術(shù)開發(fā)及檢測服務(wù)的綜合性公司。公司建有國際認(rèn)證的檢測實(shí)驗(yàn)室為技術(shù)后盾，先后在食品安全領(lǐng)域推出四個(gè)專業(yè)性技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)品應(yīng)用平臺(tái)。目前研發(fā)應(yīng)用已覆蓋至真菌毒素、藍(lán)藻/海洋毒素、食品過敏原、轉(zhuǎn)基因、食品成分分析（糖類、酸類、醇類）、維生素、違禁添加物等領(lǐng)域，尤其是生物毒素類標(biāo)準(zhǔn)品、穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(13C,15N)、免疫親和柱、多功能凈化柱、ELISA試劑盒/膠體金檢測試紙及樣品前處理儀器等產(chǎn)品在不同行業(yè)得到廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。Pribolab努力以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品賦檢測于精準(zhǔn)，創(chuàng)新研發(fā)推進(jìn)檢測技術(shù)進(jìn)步。
Pribolab將以持續(xù)創(chuàng)新的態(tài)度，致力于食品安全每一天。
隨著國家對生物毒素類污染殘留的監(jiān)管力度加大，各級實(shí)驗(yàn)室都面臨著盡快建立切實(shí)可行的檢測方法，普瑞邦(Pribolab)特組織技術(shù)人員認(rèn)真研讀食品、糧油、飼料（以及寵物食品）及中藥等行業(yè)真菌毒素檢測國家標(biāo)準(zhǔn)以及國家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測要求，并在此就2020版藥典《中國藥典》編寫了《中藥材中黃曲霉毒素分析方法解決方案》，供中藥材檢測實(shí)驗(yàn)室人員參考查詢。
普瑞邦自成立以來，始終堅(jiān)持誠信、協(xié)作、創(chuàng)新、發(fā)展的價(jià)值觀，肩負(fù)立足創(chuàng)新，以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品賦檢測于精準(zhǔn)，以創(chuàng)新技術(shù)推進(jìn)檢測技術(shù)進(jìn)步的使命，專注于真菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)。繼2017年全自動(dòng)免疫親和柱操作儀推出之后，2018年年初普瑞邦（青島）技術(shù)中心在國內(nèi)率先推出擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的展青霉素、嘔吐毒素、環(huán)匹阿尼酸、黃曲霉素等一系列13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，成為全球第二家擁有自主研發(fā)生產(chǎn)真菌毒素13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的供應(yīng)商。產(chǎn)品線涵蓋真菌毒素固/液標(biāo)準(zhǔn)品、13C穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)、質(zhì)控樣品、前處理凈化柱(多功能凈化柱和免疫親和柱、分子印跡柱) 、酶聯(lián)免疫試劑盒、檢測卡以及樣品前處理自動(dòng)化儀器（全自動(dòng)免疫親和柱操作儀、自動(dòng)化均質(zhì)器、自動(dòng)配標(biāo)儀），光/電化學(xué)類衍生器等設(shè)備。也提供維生素、抗生素、過敏原檢測、轉(zhuǎn)基因檢測和食品酶法分析試劑盒等多類產(chǎn)品。
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一、 2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法
二、 2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀
三、 SN/T 4604-2016進(jìn)出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）
四、 復(fù)雜中藥材樣品測定解決方案
五、 Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定
六、 中藥材黃曲霉毒素測定采購指南
七、 中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例
一、2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法
第一法 液相色譜法
本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
1. 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑
2. 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）
3. 采用柱后衍生器檢測
4. ①碘衍生法：衍生溶液為0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀釋至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃；②光化學(xué)柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化學(xué)柱后衍生器.Pribolab-MDU光化學(xué)柱后衍生器）
5. 熒光檢測器檢測，激發(fā)波長：360nm(365nm) 發(fā)射波長：450nm
6. 兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。
（二）混合對照品溶液的制備
精密量取PriboFast ® STD#1082AFT黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。
（三）供試品溶液的制備
1. 取供試品粉末約15g(過二號篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度大于11,000 r/min,普瑞邦均質(zhì)器Pribolab® WR800: 轉(zhuǎn)速22,000 r/min）。
2. 4000r/min離心5分鐘。
3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（專用淋洗緩沖液）稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min）
4. 準(zhǔn)確移取20.0mL樣品提取液，過PriboFast® 免疫親和柱，過柱時(shí)流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。
5. 用水20mL洗脫（必要時(shí)可先用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗滌液棄去。
6. 為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進(jìn)行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當(dāng)溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進(jìn)行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(免疫親和柱操作建議使用PriboFast®泵流操作架,便于控制各個(gè)步驟流速,保證較好的回收率)
7. 測定法：分別精密吸取上述混合對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。
第二法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
以十八烷基硅烷鍵硅膠填充劑；以10mmol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B；柱溫25℃；流速0.3mL/min；按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫。
以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測；噴霧離子源ESI)，采集模式為離子模式；各化合物監(jiān)測離子對和撞壓(CE)見下表。
（二）系列混合對照品溶液的制備
精密量取黃曲霉毒素混對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含黃曲霉毒素B2、G2濃度為0.04〜3ng/mL，黃曲霉毒素B1、G1濃度為0.12〜l0ng/mL的系列對照品溶液，即得（必要時(shí)根據(jù)樣品實(shí)際情況，制系列基質(zhì)對照品溶液）
（三）供試品溶液的制備同第一法
測定法精密吸取上述系列對照品溶液各5μL,注入高效液相色譜-質(zhì)譜，測定峰面積，以峰面積縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)。另精密吸取上述供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，計(jì)算，即得。
第三法 酶聯(lián)免疫法
本法系用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B1，或黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2總量計(jì)），除另有規(guī)定外，按下列方法測定。
（一）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
精密量取 PriboFast®STD#1041黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，PriboFast®STD#1082AFT黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用硫酸鹽緩沖液稀釋成每1L含0 µg、0.05 µg、0.15 µg、0.45 µg、1.35 µg（測定黃曲霉毒素B1）或0 µg、0.025 µg、0.075 µg、0.225 µg、0.675 µg（測定黃曲霉毒素總量）的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即得。
（二）供試品溶液的制備
1. 供試品粉末2.0g至50mL離心管中，20mL甲醇振蕩5min，離心5min（3000r/min）。
2. 取2mL上清液至10mL干凈離心管中，50-60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈伞?br /> 3. 加入2mL去離子水振動(dòng)30秒，加入6mL三氯甲烷振蕩2min，離心5min（3000r/min）。
4. 取下層三氯甲烷液3-10mL于離心管中，置氮吹儀于50-60℃水浴濃縮至干，加入1mL正己烷渦旋30秒，再加入2mL磷酸鹽緩沖液渦旋1min，離心5min（3000r/min），取下層液，即得。
（三）測定法
黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素總量的測定：分別采用合適濃度的抗體包被微孔板孔，經(jīng)封閉、干燥等處理后加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入經(jīng)酶標(biāo)抗原稀釋液稀釋至合適工作濃度的酶標(biāo)抗原，混勻，于25℃反應(yīng)45min，用洗滌工作液洗滌，每孔加入底物顯色液100μL，于25℃反應(yīng)15min，每孔加入終止液50μL，采用酶標(biāo)儀于450nm處，參比波長630nm，測定每孔吸光度值。
注：
（1）測定前，可選擇陰性樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，樣本回收率應(yīng)在60%-120%。
（2）線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990。
（3）供試品溶液百分吸光率超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍時(shí)，須對已制備好的供試品溶液進(jìn)行稀釋，使其百分吸光率落入曲線范圍后再檢測。
（4）當(dāng)測定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。
【附注】
1. 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。
2. 殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。
二、2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀
三、SN/T 4604-2016 進(jìn)出口中藥材中真菌毒素的測定（節(jié)選）
1. 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出口中藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出口當(dāng)歸、桔梗五味子、枸杞、大青葉、金銀花、地龍中黃曲霉素B1、B2、G1、G2、M1、M2，赭曲霉素A，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內(nèi)脂類真菌毒素的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測方法。
2. 分析步驟
(1) 提取
稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘?jiān)屑尤?5 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。
(2) 免疫親和柱凈化
稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質(zhì)提取2 min，5 000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘?jiān)屑尤?5 mL甲醇，均質(zhì)提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。
將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下,將50 mL提取液B全部通過免疫親和柱(PriboFast®復(fù)合免疫親和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐溫的PBS淋洗親和柱，再將5mL提取液A通過免疫親和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通過親和柱，用5mL含0.1%吐溫的PBS和20mL水淋洗親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱，棄去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，當(dāng)甲醇大部分過柱時(shí)，停止加壓，靜置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；將淋洗液置于40℃下水浴氮?dú)獯蹈�，�? mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(40：60體積比)溶解殘?jiān)�，過0.22 μm有機(jī)系濾膜，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定。
四、復(fù)雜中藥材樣品測定解決方案
針對目前藥典方法檢測中藥材中黃曲霉毒素過程中出現(xiàn)的決明子、遠(yuǎn)志、檳郎等個(gè)別樣品基質(zhì)復(fù)雜，凈化效果差，譜圖中雜質(zhì)峰過多的問題，普瑞邦技術(shù)中心制定了一套針對中藥材前處理的解決方案。應(yīng)用此解決方案進(jìn)行樣品前處理，經(jīng)高效液相色譜柱后光化學(xué)衍生進(jìn)行檢測可達(dá)到較好的凈化效果，雜峰明顯減少，使分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。供廣大同行老師參考：
圖1 方法優(yōu)化后（左）與優(yōu)化前（右）遠(yuǎn)志樣品過柱對比
圖2 方法優(yōu)化后遠(yuǎn)志樣品加標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)品疊加對比
圖3 方法優(yōu)化前遠(yuǎn)志樣品加標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)品疊加對比
五、Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀應(yīng)用于藥典中黃曲霉毒素測定
通過Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀在2015版藥典中檢測黃曲霉的案例，對比手工的精密度和回收率。全自動(dòng)免疫親和操作儀不但在具體的方法操作和技術(shù)運(yùn)用上更加先進(jìn)，而且在整個(gè)分析過程中都有非常嚴(yán)格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，確保分析結(jié)果準(zhǔn)確，排除人為操作造成的實(shí)驗(yàn)誤差。
黃曲霉毒素B、G混標(biāo)
表1：精密度與回收率比對表
| 序號 | 手動(dòng) | IPS | ||||
| 結(jié)果μg/kg | 回收率% | 精密度% | 結(jié)果μg/kg | 回收率% | 精密度% | |
| 1（遠(yuǎn)志樣品） | ND | —— | —— | ND | —— | —— |
| 2（遠(yuǎn)志加標(biāo)） | 7.03 | 70.3 | 11.1 | 7.74 | 77.4 | 5.7 |
| 3（遠(yuǎn)志加標(biāo)） | 8.71 | 87.1 | 8.66 | 86.6 | ||
| 4（遠(yuǎn)志加標(biāo)） | 7.53 | 75.3 | 8.05 | 80.5 | ||
*注：上表采用遠(yuǎn)志樣品，按照10μg/kg進(jìn)行添加。
表2：成本及操作比對表
| 對比 | 時(shí)間成本 | 操作 |
| 手動(dòng) | 2h | 復(fù)雜 |
| IPS | 1h | 簡單 |
| IPS優(yōu)勢 | 節(jié)省1h | 簡單、一致性好 |
*注：上表按照4支柱子進(jìn)行對比。
Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀在進(jìn)行過免疫親和柱實(shí)驗(yàn)中得到了優(yōu)于手動(dòng)過柱的結(jié)果，通過比對不難發(fā)現(xiàn)，Auto IPS-6060 全自動(dòng)免疫親和操作儀在回收率和精密度方面有所提高，大大節(jié)省了人力以及時(shí)間成本，同時(shí)也縮短了實(shí)驗(yàn)人員接觸試劑的時(shí)間，最大程度地保證了實(shí)驗(yàn)人員的安全。
六、中藥材黃曲霉毒素測定采購指南
| 產(chǎn)品描述 | 規(guī)格 | 貨號 | 備注 | |
| KRC光化學(xué)衍生器 | KRC-15 | KRC10230 | Pribolab | |
| 254nm低壓紫外燈光源+15米反應(yīng)池 | 8W | —— | 標(biāo)配 | |
| MDU 光化學(xué)衍生器 | MDU-I | MDU20230 | Pribolab | |
| 低壓紫外燈光源+全透明質(zhì)化反應(yīng)池 | 9W | —— | 標(biāo)配 | |
| 液相色譜柱 MycoChrm C18 | 5μm4.6*150 | 185150 | AFT專用 | |
| 不銹鋼高速均質(zhì)器 | 1.1L | EQ-800S | >20000r/min | |
| 中藥材專用黃曲霉毒素 免疫親和柱（1mL） |
25T | IAC-011-1 | —— | |
| 中藥材專用黃曲霉毒素 免疫親和柱（3mL） |
25T | IAC-011-3 | —— | |
| 多毒素復(fù)合免疫親和柱 | 15T | IAC-400-6 | 出入境標(biāo)準(zhǔn) | |
| 中藥專用緩沖液 | 份 | —— | 標(biāo)配 | |
| 固定/旋轉(zhuǎn)泵流操作架 | 8/12位 | EQ-RACK 8/12 | —— | |
| 玻璃纖維濾紙 | 100P | GF/A-110 | 110mm 1.5μm | |
| PEEK兩通 | 2P | SP0802 | —— | |
| 黃曲霉毒素總量混合標(biāo)準(zhǔn)品 (AFB1,G11.0µg/mL;AFB2,G20.3µg/mL) |
1mL | STD#1082 | —— | |
| 收集瓶 | —— | 20個(gè) | —— | |
*備注包括1年免費(fèi)保修和終身維護(hù)(反應(yīng)池和納米燈管除外).
七、中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例
1. 樣品中目標(biāo)峰保留時(shí)間發(fā)生偏移
2. 部分中藥材前處理不干凈，液相雜峰多
3. 樣品中峰的定性判斷
4. 遠(yuǎn)志、檳郎等過柱困難的樣品處理
5. 液相色譜峰拖尾或前沿
6. 色譜柱如何維護(hù)
7. 標(biāo)準(zhǔn)品的保存與分解
8. 樣品加標(biāo)回收的方法
9. 曲線線性不好
10. 基線不平，噪音大
注：如有問題請與我們聯(lián)系！
此文件僅供參考，具體內(nèi)容以2020版藥典為準(zhǔn)。
本文件中的信息，如有改變，恕不另行通知。
青島普瑞邦生物工程有限公司
關(guān)于Pribolab:
Pribolab成立于2008年，專注于食品安全（尤其生物毒素）檢測產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用。經(jīng)過十多年的發(fā)展，公司已成為集產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)用、生產(chǎn)銷售、檢測技術(shù)開發(fā)及檢測服務(wù)的綜合性公司。公司建有國際認(rèn)證的檢測實(shí)驗(yàn)室為技術(shù)后盾，先后在食品安全領(lǐng)域推出四個(gè)專業(yè)性技術(shù)研發(fā)與產(chǎn)品應(yīng)用平臺(tái)。目前研發(fā)應(yīng)用已覆蓋至真菌毒素、藍(lán)藻/海洋毒素、食品過敏原、轉(zhuǎn)基因、食品成分分析（糖類、酸類、醇類）、維生素、違禁添加物等領(lǐng)域，尤其是生物毒素類標(biāo)準(zhǔn)品、穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(13C,15N)、免疫親和柱、多功能凈化柱、ELISA試劑盒/膠體金檢測試紙及樣品前處理儀器等產(chǎn)品在不同行業(yè)得到廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。Pribolab努力以優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品賦檢測于精準(zhǔn)，創(chuàng)新研發(fā)推進(jìn)檢測技術(shù)進(jìn)步。
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