高性能微球在多肽藥物分離純化中的應(yīng)用
由于多肽藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差、濃度低且目標(biāo)分子與雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)相類似，有的只有一個氨基酸的差別，因此多肽藥物的分離純化一直是多肽藥物生產(chǎn)過程中最具挑戰(zhàn)性的一部分，多肽分離純化也主要依賴于高性能的微球制備色譜填料，其具有分離效果好、分辨率高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點，是目前多肽藥物的主要分離純化方法。無論是多肽藥物的合成還是分離純化都離不開高性能的微球材料。
傳統(tǒng)重結(jié)晶、精餾等有機(jī)小分子藥物純化方法不適用于多肽的分離純化，高效液相色譜或?qū)游黾夹g(shù)具有極高的分離純化效率，且條件溫和，在分離純化過程中容易保持目標(biāo)分子的生物活性，成為多肽藥物分離純化的重要工具。
分離純化技術(shù)對于生物分子的形態(tài)、收率和成本具有決定性的作用。尤其是通過發(fā)酵生產(chǎn)的多肽藥物如重組胰島素，由于濃度低、雜質(zhì)復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物容易變性等使其分離成本占總成本的60%以上，而且需要多步純化過程才能滿足多肽藥物的需求，因此，分離純化技術(shù)在多肽藥物產(chǎn)業(yè)中起著十分重要的作用。
目前用于多肽藥物分離純化的層析或色譜技術(shù)主要是有三種:
一是離子交換色譜，由于多肽是由氨基酸通過酰胺鍵連接成的高分子物質(zhì)，不同多肽分子帶的表面電荷正負(fù)性質(zhì)及表面電荷數(shù)量都不同而且會隨著流動相的pH改變而改變，因此不同組份的多肽分子在離子層析介質(zhì)的電荷作用力有較大差異，因此可以通過改變水溶液的鹽濃度和pH來降低樣品組份與離子交換色譜填料的電荷作用力從而對不同多肽組份進(jìn)行洗脫分離。
離子交換樹脂分為強(qiáng)陽、強(qiáng)陰、弱陽、弱陰四種常用離子交換介質(zhì)，離子交換具有載量大、適用性強(qiáng)等特點，因此常被用于發(fā)酵多肽產(chǎn)品的粗分和中間純化過程，如重組胰島素的第一步粗分往往是用離子交換色譜。
二是反相色譜，多肽分子在極性較強(qiáng)的流動相如水的緩沖液中可以與色譜填料表面疏水基團(tuán)形成較強(qiáng)的疏水作用力而吸附在固定性表面上，然后通過降低流動相極性即增加流動相有機(jī)溶劑的比例如甲醇、乙腈等按極性強(qiáng)弱先后洗脫分離不同多肽樣品組分。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的多肽組份最先被沖洗出，而極性較弱的組份會與色譜填料有更強(qiáng)的疏水作用力因此在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。反相色譜填料分辨率很高通常用于多肽藥物分離的精純過程。
三是疏水作用色譜，與反相色譜相類似都是通過樣品組份帶有的疏水基團(tuán)與色譜填料表面基團(tuán)通過疏水作用力達(dá)到吸附的目的，然后通過調(diào)整流動相性質(zhì)來改變這種疏水作用力來達(dá)到分離的目的。
不同的是反相填料具有高密度的疏水功能基團(tuán)，疏水作用力很強(qiáng)，樣品組分在純水緩沖溶液中就可以吸附在反相填料表面，洗脫時需要增加流動相中有機(jī)溶劑的比例以降低流動相的極性；而疏水填料表面疏水基團(tuán)密度小，疏水作用力較弱，為了增加多肽的疏水作用力，在水流動相中需要增加鹽的濃度使樣品能吸附在疏水填料表面，然后只要降低流動相鹽的濃度就可以達(dá)到洗脫的目的。
疏水作用色譜優(yōu)勢是可以完全在水相體系操作，不需要有機(jī)相。常見的疏水基團(tuán)有苯基、丁基和聚醚基團(tuán)。疏水層析介質(zhì)的疏水作用力主要受流動相的鹽濃度影響，由于其在高鹽環(huán)境下，多肽分子的疏水性較好，因此其非常適用于離子交換色譜過程之后產(chǎn)品的繼續(xù)分離純化。
01
「 多肽分離純化色譜填料的選擇 」
一個理想的多肽藥物分離純化色譜填料必須滿足以下特性：
（a）高選擇性，高分離度；
（b）柱效高，分辨率高；
（c）載量大；單位體積填料處理多肽樣品的能力大
（d）化學(xué)性能穩(wěn)定，適用pH范圍寬（1-14）；可在線清洗， 耐臟性強(qiáng)，使用壽命長；
（e）機(jī)械強(qiáng)度大，反壓低；易裝柱；
（f）產(chǎn)品重現(xiàn)性好，性價比高。在現(xiàn)實中很難找到一款填料能滿足所有的要求，每種填料都有它自身的特性，選擇填料要綜合考慮成本，分離效率，產(chǎn)品純度，穩(wěn)定性等等。
如在發(fā)酵多肽的粗純或捕獲階段需要高載量色譜填料來濃縮和分離目標(biāo)多肽分子，而精純階段則要選擇分辨率高的介質(zhì)以除去性能非常類似的分子。由于色譜填料的性能取決于其化學(xué)組成、粒徑大小和分布、微球孔徑大小和分布、表面功能基團(tuán)及密度等。
用于多肽分析和分離純化的液相色譜填料主要基質(zhì)有三大類：
第一類是多孔二氧化硅（硅膠）為基質(zhì)的色譜填料；
第二類是天然碳水高分子改性填料包括改性纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等；
第三類是合成高分子色譜填料包括交聯(lián)聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等。
反相硅膠色譜已成為多肽分析和制備色譜的主流介質(zhì), 但硅膠表面的硅氧鍵耐堿性差的缺點使得這一填料不適合在堿性條件下分離和分析多肽分子和需要用堿性條件下再生的純化分離過程中。
天然碳水高分子改性填料由于具有親水強(qiáng)，能減少對生物分子的非特異性吸附等特點因此在分離過程中容易保持生物分子的生物活性而被廣泛地用于生物大分子的分離純化，其主要的缺點是機(jī)械強(qiáng)度差，溶脹體積大，流速慢等等。
交聯(lián)聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯由于機(jī)械強(qiáng)度好且合成聚合物微球的粒徑,粒徑分布及孔道結(jié)構(gòu)容易控制，通過表面親水化改性后可以降低生物分子的非特異性吸附，而且克服了天然碳水高分子介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度差，溶脹體積大的缺點使生物分離純化更加快速、高效。
因此合成高分子填料被越來越多地替代天然高分子改性填料用于多肽分子的分離純化。交聯(lián)聚苯乙烯填料由于本身就帶有疏水的苯基，不需要通過表面鍵合烷基功能基團(tuán)就可直接用作反相填料，交聯(lián)聚苯乙烯填料具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度及極高的耐堿性和極長壽命等特點使其被越來越多地用來替代反相硅膠用于中小分子工業(yè)分離純化過程中。
用于多肽分析和分離純化的液相色譜填料主要基質(zhì)性質(zhì)對比
1）硅膠色譜填料
在高效液相色譜領(lǐng)域，二氧化硅(硅膠)及硅膠鍵合分離填料因具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，耐溶劑性，孔道結(jié)構(gòu)及比表面積容易控制，優(yōu)異的耐熱性能，及表面富含易于鍵合或改性的硅羥基使得硅膠成為高效色譜填料應(yīng)用歷史最悠久也是應(yīng)用最為廣泛的高效液相色譜填料。
2）聚合物色譜填料
然而在多肽類藥物的研究與開發(fā)中，往往因在下游的分離與純化過程中所存在的技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致難以獲得令人滿意的目標(biāo)多肽或制備規(guī)模。
聚合物分離介質(zhì)因其良好的分離效果、穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)及高吸附載量，在多肽類藥物的分離與純化中得到越來越廣泛的應(yīng)用，也為多肽的分離介質(zhì)選擇提供了新的途徑。
按照聚合基體的不同，聚合物可以分為聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分別是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為聚合單體，加入致孔劑聚合而成。
早期的聚合物分離介質(zhì)因孔徑較大，稱為大孔吸附樹脂，其性質(zhì)介于天然吸附劑（活性炭、硅膠和硅藻土）和離子交換劑之間。
目前大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于中藥提取液及多肽的分離純化，但因大孔吸附樹脂本身粒徑較大等因素導(dǎo)致其分離能力較低，在物質(zhì)的精細(xì)分離純化中很難達(dá)到所需的純化要求及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
隨著聚合技術(shù)的發(fā)展，新型的精細(xì)聚合物分離介質(zhì)隨之誕生。精細(xì)聚合物分離介質(zhì)一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯為單體聚合而成，其粒徑分布為數(shù)微米至數(shù)百微米，具有更窄的粒徑分布、更優(yōu)化的孔徑結(jié)構(gòu)及更高的比表面積，因此擁有更好的分離度和吸附載量。
與反相硅膠色譜填料相比，首先，聚合物色譜填料微球的骨架結(jié)構(gòu)是由C-C鍵構(gòu)成，比Si-O-Si鍵以及多糖的糖苷鍵，其化學(xué)穩(wěn)定性最好，在整個pH范圍內(nèi)都可以長期使用，還能用NaOH 溶液直接清洗和再生；
其次，通過聚合方法，可以很容易地獲得從軟凝膠型至不同硬度，不同孔徑、不同大小的微球，特別是通過化學(xué)方法，對微球進(jìn)行功能化，可以很容易地獲得具有各種表面性質(zhì)的微球。因此，越來越多的被用來替代反相硅膠用于多肽等生物分子工業(yè)純化過程中。
3）聚合物和反相硅膠色譜填料的互補性能
硅膠和聚合物為基質(zhì)的填料是色譜分離和分析領(lǐng)域必不可少的兩種性能互為補充的色譜介質(zhì)。
硅膠基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度大、柱效高、分辨率好，已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化合物及中性分子的分析和大規(guī)模制備生產(chǎn)中；而聚合物基質(zhì)填料則具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性及無與比擬的耐酸堿性，因此使用壽命長，可在線清洗適合生物分子的大規(guī)模純化分離。
研究證明，由于硅膠和聚合物色譜填料內(nèi)存在材料基質(zhì)的差別，它們在對目標(biāo)分子分離選擇性方面具有極強(qiáng)的互補性，如一些用聚合物填料很難分離的物質(zhì)，在硅膠填料上卻能得到良好分離。
相反地，一些在硅膠填料上很難分離的物質(zhì)，而用聚合物填料能得到有效的分離。納微科技可同時提供硅膠、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯/二乙烯基苯為基質(zhì)的三種性能互補的高質(zhì)量的單分散均粒色譜填料以滿足不同客戶的需求。
02
「 色譜填料孔徑對多肽分離純化的影響 」
除了體積排阻色譜外，其它色譜分離機(jī)理都離不開樣品與色譜填料表面的作用。
色譜填料孔徑大小、分布及比表面積對多肽分離性能也有重大的影響，對于分子量小于1000的多肽樣品，一般選擇孔徑在100Å 以下的就可以。
對于大多數(shù)分離模式來說有效的比表面積越大，載量越大，但有效比表面積取決于目標(biāo)樣品的分子量、孔徑大小及孔容積。
這里指的有效比表面積是針對特定物質(zhì)分離條件下有用的孔道比表面積總和，無效的比表面積是指孔徑小于一定尺寸，目標(biāo)分子不能進(jìn)出，在分離過程這些小于一定尺寸的孔道所產(chǎn)生的比表面積不能起到分離作用，因此要根據(jù)分離的樣品的分子量來選擇合適孔徑的色譜填料。
如胰島素分子量大概在6000左右，如果使用C8反相硅膠色譜填料分離純化，一般選用粒徑10微米，孔徑100Å左右的色譜填料；
如果選用孔徑小于80Å的C8硅膠色譜填料，雖然測得該填料比表面積比孔徑100Å色譜填料要大，但該色譜填料分辨率和載量會比100Å色譜填料低很多；
如果選擇孔徑過大的色譜填料，如200Å的色譜填料，該填料比表面積比100Å的相對會減小，導(dǎo)致載量降低，同時孔徑大的硅膠填料機(jī)械強(qiáng)度也比孔徑小的機(jī)械強(qiáng)度要差。
對于聚合物色譜填料需要的孔徑會比硅膠要大，一般300Å聚合物色譜填料就相當(dāng)于100Å硅膠色譜填料。
如果孔徑保持一致條件下，孔容積越大，比表面積也越大，單位體積的硅膠含量越少，因此機(jī)械強(qiáng)度則越差。
在其它條件不變，一般選擇有效比表面積越大的填料越好，這樣載量大，機(jī)械強(qiáng)度好。一般來說孔容積越大載量越大，分離效果也越好，但孔容積越大，機(jī)械強(qiáng)度越差。因此對于一般多肽分析和分離用色譜填料孔容積要求在0.5-1.0ml/g左右，如果用于體積排阻利用分子篩性質(zhì)的填料孔容積要求會大于1.3ml/g。
另外小于50Å的微孔的存在對部分樣品組分的分離效果有影響，因此在做硅膠表面鍵合之前最好把這些微孔封掉。
常規(guī)色譜填料粒徑大小分別有1.7、3、5、8、10、12、15、20、30、40、50微米；常規(guī)孔徑可選擇0.05nm（50Å）、0.1nm（100Å）、0.12nm （120Å）、0.17nm （200Å）、0.3nm （300Å）、0.1nm（500Å）。因此要根據(jù)目標(biāo)多肽樣品的分子量選擇合適孔徑色譜填料。
03
「 填料粒徑大小及均一性對多肽分離純化的影響 」
色譜填料的粒徑主要影響填充柱的的柱效和背壓。填料粒徑越小，填充柱的柱效越高，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度。填料粒徑越小，柱壓也越高，因此對色譜系統(tǒng)的要求也越高，設(shè)備投資也越大，小粒徑色譜填料的價格也高。
因此用于工業(yè)制備的色譜填料顆粒粒徑往往在10微米以上, 常規(guī)HPLC色譜柱硅膠填料粒徑在3-5微米之間, 而用于UPLC 的色譜填料在2微米以下。
選擇色譜粒徑大小要綜合考慮分離效率和成本。下圖是用納微科技UniPS系列不同粒徑聚合物色譜填料（粒徑分別為10、20、30微米）對多肽、蛋白等分離效果的影響。
不同粒徑的色譜填料對多肽和蛋白質(zhì)分離效果的對比
除了粒徑的大小外，色譜填料的粒徑分布情況也是色譜填料性能的重要參數(shù)。在高效液相色譜分離過程中，流動相流過的通路主要是粒狀填料間的間隙，而填料粒徑大小、均一性及填充柱床緊密程度的不均一性，都會使填充柱產(chǎn)生多路徑效應(yīng)。
使溶質(zhì)分子在填充柱床中的流動路徑和保留時間發(fā)生變化，導(dǎo)致色譜峰變寬，從而影響溶質(zhì)分子分離效果。
當(dāng)色譜微球填料粒徑分布較寬，相同的溶質(zhì)分子流過色譜柱時，在填充柱床內(nèi)產(chǎn)生不同的通路，導(dǎo)致經(jīng)過的路徑長短不同，相應(yīng)的保留時間也有所不同，使色譜峰展寬，理論塔板數(shù)變小，柱效降低。
當(dāng)使用粒徑均一的微球填料填充色譜柱時，因其緊密程度一致，有效減少了填充床的多路徑效應(yīng)，使溶質(zhì)分子流過色譜柱時經(jīng)歷的路徑長度基本相同，相應(yīng)的保留時間也較一致，使色譜峰寬變窄，理論塔板數(shù)升高，從而獲得較高的柱效（粒徑均一性對分離柱效的影響如圖8所示），在小分子及多肽的反相分離中獲得較好的分離效果。
粒徑均一性對分離柱效的影響
用于多肽藥物分離純化的色譜填料要求極高，因此制備技術(shù)壁壘高，世界上真正具備規(guī)模化生產(chǎn)能滿足色譜需求的多分散多孔球形硅膠的廠家只有Kromasil, Daisol，F(xiàn)uji及Merck等四家。
而可以生產(chǎn)聚合物色譜填料的廠家主要有美國GE，日本Tosoh 等少數(shù)公司。目前大多數(shù)市場上的色譜填料無論是硅膠基質(zhì)還是聚合物基質(zhì)粒徑分布都較寬，因此開發(fā)單分散色譜填料的技術(shù)一直是業(yè)界的發(fā)展目標(biāo)，也是該領(lǐng)域的技術(shù)難題。
納微科技致力于研究單分散微球材料的制備和應(yīng)用的高科技企業(yè)，不僅成功地開發(fā)出單分散多孔聚合物微球，而且成為世界第一家開發(fā)出單分散硅膠填料的大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)，并獲得國家發(fā)明專利。
先進(jìn)微球材料是多肽藥物發(fā)展的基礎(chǔ)，無論是用于多肽固相合成的微球載體還是用于分離純化和檢測的色譜填料都離不開高性能微球材料，微球材料制備技術(shù)的進(jìn)步會促進(jìn)多肽藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
蘇州納微科技股份有限公司（簡稱納微）專門從事高精度、高性能和高附加值微球材料研發(fā)和生產(chǎn)的國家高新技術(shù)企業(yè)，致力于建設(shè)世界領(lǐng)先的納微米球精準(zhǔn)制備和應(yīng)用平臺，是世界上能提供最多微球品種與規(guī)格的公司之一。
納微擁有單分散色譜填料的精準(zhǔn)制備技術(shù)、表面功能化技術(shù)和規(guī)模化生產(chǎn)能力；產(chǎn)品涵蓋硅膠正相、反相、HILIC、手性填料，聚合物反相、離子交換、疏水層析、親和層析（ProteinA、金屬螯合、苯硼酸）、固相萃取、凝膠滲透色譜及特殊功能填料；還提供色譜柱、磁珠、標(biāo)準(zhǔn)顆粒、分析檢測、分離純化實驗技能培訓(xùn)及分離純化整體解決方案。納微已實現(xiàn)大規(guī)模出口高性能色譜填料到歐、美、日、韓等國家和地區(qū)的國際知名制藥和色譜企業(yè)，成為世界色譜行業(yè)的領(lǐng)軍企業(yè)之一。
納微承擔(dān)國家戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項（2013年蛋白類生物藥和疫苗發(fā)展專項）、國家科技支撐計劃項目課題，建成江蘇省納微米球材料工程中心及工程技術(shù)研究中心，成立蘇州納微先進(jìn)微球材料應(yīng)用技術(shù)研究所，已獲得國家發(fā)明專利19項，獲1項國家重點新產(chǎn)品和4項江蘇省高新技術(shù)產(chǎn)品。
納微在蘇州工業(yè)園區(qū)建成13000m2的研發(fā)及生產(chǎn)中心，2019年在常熟建成18000m2的生產(chǎn)基地，納微已通過ISO9001質(zhì)量管理體系認(rèn)證，為客戶提供完善的技術(shù)支持文件。納微始終堅持“以創(chuàng)新，贏尊重，得未來”的理念，致力于打造具有國際影響力的納微米球材料國家企業(yè)技術(shù)中心。
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