Celigo成像分析技術(shù)在細(xì)胞殺傷中的應(yīng)用

2018年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予了兩位免疫學(xué)家，分別是美國的James P Allison和日本的本庶佑教授，以表彰他們的原創(chuàng)發(fā)現(xiàn)推動了免疫學(xué)研究的進(jìn)程，促使了癌癥治療領(lǐng)域革命性新藥物的面世。



如今炙手可熱的PD-1， CAR-T，TCR-T技術(shù)等都要?dú)w功于這一偉大發(fā)現(xiàn)及其臨床應(yīng)用。如果你的工作也和免疫療法相關(guān)，是不是像小編一樣也有一丟丟自豪，感覺自己參與見證了人類疾病史上的一次飛躍呢？

雞血打滿了，該好好干活了！

無論名字多么fancy的療法，有沒有用還是得看它能否消滅腫瘤細(xì)胞。在體外實驗中，抗體或經(jīng)改造的免疫細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）對腫瘤細(xì)胞（靶細(xì)胞）的殺傷是評估療法效價的不可缺少的評判標(biāo)準(zhǔn)之一。多年來，科學(xué)家們已開發(fā)出了多種免疫細(xì)胞殺傷的檢測方法，小編總結(jié)如下：

這些方法原理不同，也各有利弊。比如許多實驗室常用的乳酸脫氫酶 (LDH) 釋放法是通過檢測細(xì)胞裂解后釋放到培養(yǎng)基中的LDH來反映細(xì)胞的殺傷程度的。然而免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都含有LDH，死亡后都會釋放到培養(yǎng)基中，因此酶標(biāo)儀的讀數(shù)無法特異性地區(qū)分出腫瘤細(xì)胞的死亡，結(jié)果容易受到死亡的免疫細(xì)胞的影響。另外，該方法需設(shè)置多組對照，如無釋放組（不加免疫細(xì)胞）和最大釋放組（加Triton X-100完全裂解）來確定最低和最高的OD值讀數(shù)。如果對照組和實驗組的細(xì)胞鋪板密度不均勻，極易造成誤差，甚至出現(xiàn)實驗組殺傷效率為負(fù)數(shù)的奇怪結(jié)果。

再比如Luciferase報告基因法，是將Luciferase的基因片段連接在與T細(xì)胞激活相關(guān)基因 (比如IL-2或NFAT) 的啟動子之后，通過Luciferase的表達(dá)來反映T細(xì)胞的激活程度。簡言之是在分子水平檢測T細(xì)胞的激活。做該實驗需自行改造T細(xì)胞或購買改造好的T細(xì)胞系，不夠靈活，具有較大的局限性。

列表中的所有方法還有一個共同缺憾，就是看不到細(xì)胞。有圖才有有真相，細(xì)胞殺傷連個細(xì)胞的影子都沒有，光讓咱們相信這些數(shù)字，心里是不是有點(diǎn)虛？實驗失敗了也很難找原因。另外每次實驗只能測一個時間點(diǎn)，想測多個時間點(diǎn)得鋪多塊板，想想就好累！

檢測免疫細(xì)胞殺傷有沒有既靠譜又簡單的方法呢？誰說沒有呢？科技的發(fā)展日新月異，小編今天就給大家介紹一下做免疫細(xì)胞殺傷的最新方法：

Calcein AM染色法

• Calcein AM是一種可以滲透細(xì)胞膜的染料，通常用來檢測真核細(xì)胞的存活率

• 在活細(xì)胞中，本來不發(fā)熒光的Calcein AM被胞內(nèi)酯酶水解后轉(zhuǎn)化為成發(fā)綠色熒光的Calcein

• 在細(xì)胞殺傷實驗中，用 Calcein AM標(biāo)記靶細(xì)胞，發(fā)出綠色熒光；效應(yīng)細(xì)胞不染色以示區(qū)別。當(dāng)靶細(xì)胞裂解后，由于胞內(nèi)的Calcein釋放到培養(yǎng)基中，細(xì)胞失去熒光。通過計算綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量即可得到活靶細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞殺傷效率。

*詳細(xì)原理可查閱我司Nexcelom Bioscience和德克薩斯大學(xué)MD Anderson癌癥研究院合作發(fā)表的文獻(xiàn)【1】。

這么好的方法當(dāng)然需要一個強(qiáng)大的檢測儀器來支撐 – Celigo成像細(xì)胞定量分析儀：

● 明場+四色熒光

● 全孔成像，圖片清晰，適用于6-1536孔板

● 定量分析全孔細(xì)胞數(shù)目

● 軟件自帶流式設(shè)門分析功能

● 高速同步成像和分析，15分鐘內(nèi)完成一塊96孔板的免疫殺傷檢測

現(xiàn)在小編就以NK細(xì)胞的ADCC（抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷）為例子來展示用Celigo做免疫細(xì)胞殺傷的效果：
 

 

• 全孔成像，分析孔內(nèi)每一個細(xì)胞

• 避免細(xì)胞分布不均帶來的局部視野誤差

• 多時間點(diǎn)檢測時，避免因細(xì)胞遷移而造成的局部視野前后不一致
 

• 綠色熒光通道展示被Calcein AM標(biāo)記的靶細(xì)胞

• Celigo軟件將細(xì)胞圈定，便于用戶查看細(xì)胞識別是否準(zhǔn)確

 

 • 在不同時間點(diǎn)將板放入Celigo進(jìn)行檢測

 • 隨著時間的推進(jìn)，綠色熒光細(xì)胞（即活的靶細(xì)胞）的數(shù)量逐漸減少

*每孔下方數(shù)字為0小時綠色熒光細(xì)胞密度
 

• Celigo軟件自動生成每孔綠色銀光細(xì)胞隨時間變化的曲線，各孔殺傷情況一目了然

• 原始數(shù)據(jù)可導(dǎo)出為Excel或GraphPad格式進(jìn)行后續(xù)分析

t0為0小時；t為檢測時間點(diǎn)；treated為加抗體組；control為未加抗體組
 

• 如上計算公式即可算出每孔的細(xì)胞裂解率

• 每孔數(shù)據(jù)都由該孔0小時和檢測時間點(diǎn)的熒光細(xì)胞數(shù)相比較得出，不需額外設(shè)置對照組，避免了不同孔間鋪板密度的差異造成的誤差

 • 根據(jù)數(shù)據(jù)繪制出細(xì)胞裂解曲線

 

• 將明場和綠色熒光圖片疊加，可觀察NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的相互作用

• 在一定抗體濃度下，隨著時間的推進(jìn)，NK細(xì)胞逐漸在腫瘤細(xì)胞周圍聚集，時間越久聚團(tuán)越明顯，活的腫瘤細(xì)胞也越少

• 在相同時間點(diǎn)，隨著抗體濃度的增高，NK細(xì)胞逐漸在腫瘤細(xì)胞周圍聚集，濃度越高聚團(tuán)越明顯，活的腫瘤細(xì)胞也越少

有了這樣的圖片，你是不是會底氣十足地在組會上匯報：腫瘤細(xì)胞真的被免疫細(xì)胞殺得片甲不留，此乃我親眼所見！

除了NK細(xì)胞, Calcein AM染色法也能運(yùn)用在PBMC、CIK、中性粒細(xì)胞、CAR-T等其他免疫細(xì)胞的殺傷。不過呢，Calcein AM也有一個小小缺點(diǎn)，那就是它的熒光半衰期太短，所以該方法只適用于時程較短（< 6小時）的殺傷實驗。如果你的殺傷實驗時程較長也不用擔(dān)心，Nexcelom的科學(xué)家們早已開發(fā)出其他方法來應(yīng)對各種各樣的實驗條件，需要了解的可以給小編留言噢，我們也會在今后的文章中作詳細(xì)介紹，敬請期待！

參考文獻(xiàn)

【1】Somanchi S S, McCulley K J, Somanchi A, et al. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0141074.

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