基于微流體的單細(xì)胞打印系統(tǒng)提高細(xì)胞系開發(fā)效率
細(xì)胞系開發(fā)和單克隆性的保證是生產(chǎn)生物藥物分子（例如單克隆抗體）過程的關(guān)鍵步驟。該過程開始于將編碼目的蛋白的基因遞送至靶細(xì)胞。在分離出能穩(wěn)定表達目的蛋白的單個活細(xì)胞之后便可建立細(xì)胞系。該過程中的一個重要里程碑是記錄克隆性證明，以確保細(xì)胞系的遺傳可復(fù)制性。隨后的步驟包括對克隆進行表征以提高生產(chǎn)力（效價），質(zhì)量和穩(wěn)定性（圖1）。當(dāng)前細(xì)胞系開發(fā)中的工作流程具有許多限制，包括細(xì)胞活力低，單細(xì)胞分離效率低和克隆性證據(jù)有限。有限稀釋的傳統(tǒng)分離單個細(xì)胞的方法僅依賴于統(tǒng)計概率，并且沒有可見的單克隆證據(jù)，該技術(shù)因其單細(xì)胞沉積效率低而導(dǎo)致每個板的篩選候選細(xì)胞很少。
圖1.上游細(xì)胞系開發(fā)中的典型工作流程
Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)（x.sight）是一種創(chuàng)新的噴墨式“打印”分選細(xì)胞的設(shè)備，用于從液體樣品中溫和而精確地分離單個細(xì)胞。X.sight使用一次性無菌的微流體芯片精確地分離單個細(xì)胞，同時在打印不同類型的細(xì)胞時也使交叉污染最小化了。
此文展示了使用單細(xì)胞打印機和有限稀釋在單細(xì)胞沉積效率以及克隆恢復(fù)率的比較。
材料與方法
用于單細(xì)胞打印或有限稀釋的細(xì)胞制備
對于單細(xì)胞打印和有限稀釋，均使用CHO-K1細(xì)胞（ATCC），使用的其他細(xì)胞系，包括HEK和L929，均以類似方式制備。為了準(zhǔn)備單細(xì)胞打印，將細(xì)胞重懸于PBS中，密度為1 x 10 6細(xì)胞/ mL。為了消除細(xì)胞團塊，在將樣品裝入打印機芯片之前，通過40 µm過濾器過濾細(xì)胞。
通過Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)進行單細(xì)胞分選
x.sight可從液體樣品中溫和而精確地分離單個活細(xì)胞，該系統(tǒng)使用一次性芯片，可在打印不同類型的細(xì)胞時減少了交叉污染。每個芯片可用于一次打印多個96孔或384孔微孔板。為了沉積單個細(xì)胞，x.sight通過壓電驅(qū)動的致動器以可預(yù)測的順序產(chǎn)生微液滴（圖2A）。高分辨率相機連續(xù)拍攝芯片噴嘴處的圖像，而成像算法分析噴嘴末端的圖像以檢測單個細(xì)胞的存在。當(dāng)識別到不包含細(xì)胞或包含多個細(xì)胞的液滴時，真空系統(tǒng)將啟動閥門，從而使這些液滴被虹吸掉。通過算法識別出單個細(xì)胞后，將觸發(fā)氣動系統(tǒng)以關(guān)閉真空閥門，從而使包裹單個細(xì)胞的液滴在打印機頭移至下一個孔之前掉入下面的孔中。
單細(xì)胞來源的克隆性證據(jù)
使用高分辨率相機在噴嘴處對一次性打印芯片成像，以確保細(xì)胞出現(xiàn)在聚焦處。當(dāng)檢測到包含單個細(xì)胞的液滴時，將捕獲5個圖像以跟蹤該單細(xì)胞下降到噴嘴末端時的狀態(tài)（圖2B）。在液滴形成之前捕獲圖像1-3，在圖像4上，軟件識別確認(rèn)檢測區(qū)域ROI中的單細(xì)胞事件，圖像5顯示液滴噴射之后的噴嘴。注意，基于噴嘴的圖像證據(jù)與在微孔板表面獲得的圖像證據(jù)是互補且具有一致性的。觀察到噴嘴和微孔板圖像之間的高度相關(guān)性為98.9％±1.8（n = 282孔）（數(shù)據(jù)未顯示）。
結(jié)果
Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)和有限稀釋的單細(xì)胞沉積效率對比
為了評估使用x.sight的單細(xì)胞打印效率，分析了芯片噴嘴的圖像，以確保在將液滴噴射到孔中之前觀察到真正的單細(xì)胞事件。根據(jù)儀器噴嘴成像的分析結(jié)果，使用x.sight獲得的單細(xì)胞打印總效率為88.5％±5.5（n = 9個微孔板）。兩/多細(xì)胞孔和無細(xì)胞孔的發(fā)生頻率要低得多（分別為6.7％和4.8％）。每個96孔微孔板的平均打印時間為8.1±2.8分鐘。一張圖片說明顯示，x.sight打印至96孔微孔板的典型結(jié)果為85孔包含1個細(xì)胞，6孔包含> 1個細(xì)胞和5孔不包含細(xì)胞（圖3A）。相比之下，理論接種密度為0.5個細(xì)胞/孔的有限稀釋液可實現(xiàn)30％的單細(xì)胞孔（28個），10％的多細(xì)胞孔（10個）和60％的空孔(58個）（圖3B）。圖3c顯示了單細(xì)胞打印和有限稀釋的空孔、單細(xì)胞孔和多細(xì)胞孔效率的直接比較。與有限稀釋相比，x.sight的單細(xì)胞沉積效率提高了約3倍，從而增加了用于下游分析的潛在克隆數(shù)。 
圖3. x.sight與有限稀釋的單細(xì)胞沉積效率對比
克隆恢復(fù)率
隨后測試了單細(xì)胞打印產(chǎn)生的克隆的生存能力，并將它們與有限稀釋產(chǎn)生的克隆進行了比較。為了量化生存力，將來自有限稀釋或單細(xì)胞打印的微孔板定期在成像設(shè)備上成像10天，直到形成明顯的細(xì)胞團。圖4A顯示了x.sight的第10天代表性板塊中，包含大量單克隆孔（總共70孔）。圖4B中顯示了有限稀釋的第10天板，其中包含27個單克隆孔。
將來自x.sight和有限稀釋的每孔的克隆團進行計數(shù)，并分類為以下三類之一：空孔，單克隆孔和多克隆孔。觀察到有63.0％±6.5的孔包含單細(xì)胞打印產(chǎn)生的單克隆孔（其中1.5％±1.4包含多個克隆，而35.5％±7.3則不含克�。Ｍ瑫r，觀察到有限稀釋的結(jié)果是26.2％±2.3的孔包含單個克�。ㄆ渲�66.4％±3.9不含克隆，而7.4％±1.9包含多個克�。D4C繪制了來自x.sight和有限稀釋的每塊板的原始單細(xì)胞克隆。為了直接測量單細(xì)胞活力，在第0天捕獲了熒光標(biāo)記的細(xì)胞，使其生長10天。對于給定的板，通過將單克隆孔的數(shù)目（單細(xì)胞孔長起來的）除以單細(xì)胞孔的數(shù)目來獲得生存力百分比。x.sight的平均生存力為84％，而極限稀釋度則為81％。同樣，比較了來自x.sight的單細(xì)胞來源克隆對不同細(xì)胞類型的生存力（圖4E）。通常，使用CHO，HEK和其他常見細(xì)胞系時，觀察到的典型生存力大于75％。重要的是要注意，細(xì)胞活力會根據(jù)細(xì)胞類型，樣品制備，設(shè)定參數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)基和其他外部因素而變化。
圖4.單細(xì)胞打印機和有限稀釋的存活率對比
（A）顯示了來自單細(xì)胞打印的第10天細(xì)胞團（綠色）。70個孔包含單個克隆團，1個孔包含2個克隆團，25個孔不包含克隆團。（B）有限稀釋平行產(chǎn)生的第10天細(xì)胞克隆團。27個孔包含單個克隆團，7個孔包含多個克隆團，62個孔不包含克隆團。（C）x.sight和有限稀釋來源的每塊板單細(xì)胞克隆率的比較。（D）比較了有限稀釋與x.sight來源的單細(xì)胞克隆的存活率。x.sight的平均生存力為84％，而有限稀釋則為81％。（E）比較了從不同類型細(xì)胞獲得的單細(xì)胞來源孔的生存力。
結(jié)論
本文展示了使用Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)（x.sight）的工作流程，該工作流程可提高單細(xì)胞分離的效率并記錄單克隆性。x.sight技術(shù)為單克隆，高效，快速的單細(xì)胞接種以及出色的細(xì)胞活力以及最小的交叉污染風(fēng)險提供了基于圖像的證據(jù)。單細(xì)胞沉積效率高（> 85％），可以更全面地使用微孔板的孔來有效分離單個細(xì)胞。在此工作流程中，克隆回收率提高了3倍，這意味著可以在下游分析更多克隆，從而在提高生產(chǎn)率的同時節(jié)省了人工時間和試劑成本。
本文只是嘗試了一種細(xì)胞密度來進行單細(xì)胞的分選，根據(jù)國內(nèi)外客戶的反饋信息，調(diào)整細(xì)胞的密度進行鋪板，單細(xì)胞率和克隆生長率能分別提高到95%和91%以上（由于信息保密性，數(shù)據(jù)尚未顯示）。
圖1.上游細(xì)胞系開發(fā)中的典型工作流程
Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)（x.sight）是一種創(chuàng)新的噴墨式“打印”分選細(xì)胞的設(shè)備，用于從液體樣品中溫和而精確地分離單個細(xì)胞。X.sight使用一次性無菌的微流體芯片精確地分離單個細(xì)胞，同時在打印不同類型的細(xì)胞時也使交叉污染最小化了。
此文展示了使用單細(xì)胞打印機和有限稀釋在單細(xì)胞沉積效率以及克隆恢復(fù)率的比較。
材料與方法
用于單細(xì)胞打印或有限稀釋的細(xì)胞制備
對于單細(xì)胞打印和有限稀釋，均使用CHO-K1細(xì)胞（ATCC），使用的其他細(xì)胞系，包括HEK和L929，均以類似方式制備。為了準(zhǔn)備單細(xì)胞打印，將細(xì)胞重懸于PBS中，密度為1 x 10 6細(xì)胞/ mL。為了消除細(xì)胞團塊，在將樣品裝入打印機芯片之前，通過40 µm過濾器過濾細(xì)胞。
通過Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)進行單細(xì)胞分選
x.sight可從液體樣品中溫和而精確地分離單個活細(xì)胞，該系統(tǒng)使用一次性芯片，可在打印不同類型的細(xì)胞時減少了交叉污染。每個芯片可用于一次打印多個96孔或384孔微孔板。為了沉積單個細(xì)胞，x.sight通過壓電驅(qū)動的致動器以可預(yù)測的順序產(chǎn)生微液滴（圖2A）。高分辨率相機連續(xù)拍攝芯片噴嘴處的圖像，而成像算法分析噴嘴末端的圖像以檢測單個細(xì)胞的存在。當(dāng)識別到不包含細(xì)胞或包含多個細(xì)胞的液滴時，真空系統(tǒng)將啟動閥門，從而使這些液滴被虹吸掉。通過算法識別出單個細(xì)胞后，將觸發(fā)氣動系統(tǒng)以關(guān)閉真空閥門，從而使包裹單個細(xì)胞的液滴在打印機頭移至下一個孔之前掉入下面的孔中。
單細(xì)胞來源的克隆性證據(jù)
使用高分辨率相機在噴嘴處對一次性打印芯片成像，以確保細(xì)胞出現(xiàn)在聚焦處。當(dāng)檢測到包含單個細(xì)胞的液滴時，將捕獲5個圖像以跟蹤該單細(xì)胞下降到噴嘴末端時的狀態(tài)（圖2B）。在液滴形成之前捕獲圖像1-3，在圖像4上，軟件識別確認(rèn)檢測區(qū)域ROI中的單細(xì)胞事件，圖像5顯示液滴噴射之后的噴嘴。注意，基于噴嘴的圖像證據(jù)與在微孔板表面獲得的圖像證據(jù)是互補且具有一致性的。觀察到噴嘴和微孔板圖像之間的高度相關(guān)性為98.9％±1.8（n = 282孔）（數(shù)據(jù)未顯示）。
圖2. Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)技術(shù)
（A）將細(xì)胞樣品裝入芯片后，將芯片安裝到單細(xì)胞打印系統(tǒng)，然后可以開始打印。在打印過程中，壓電驅(qū)動的致動器會以可預(yù)測的順序連續(xù)產(chǎn)生液滴。使用直接位于噴嘴下方的真空裝置虹吸掉不含細(xì)胞或一個以上細(xì)胞的液滴。識別出單細(xì)胞后，真空系統(tǒng)關(guān)閉，使含單細(xì)胞的液滴落入孔中。（B）當(dāng)檢測到單個細(xì)胞時，捕獲五張圖像以提供噴嘴處的克隆性證據(jù)。圖像1-3顯示了在液滴噴射之前細(xì)胞的存在，圖像4標(biāo)記了包含單個細(xì)胞的區(qū)域，圖像5顯示了液滴噴射之后的噴嘴。結(jié)果
Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)和有限稀釋的單細(xì)胞沉積效率對比
為了評估使用x.sight的單細(xì)胞打印效率，分析了芯片噴嘴的圖像，以確保在將液滴噴射到孔中之前觀察到真正的單細(xì)胞事件。根據(jù)儀器噴嘴成像的分析結(jié)果，使用x.sight獲得的單細(xì)胞打印總效率為88.5％±5.5（n = 9個微孔板）。兩/多細(xì)胞孔和無細(xì)胞孔的發(fā)生頻率要低得多（分別為6.7％和4.8％）。每個96孔微孔板的平均打印時間為8.1±2.8分鐘。一張圖片說明顯示，x.sight打印至96孔微孔板的典型結(jié)果為85孔包含1個細(xì)胞，6孔包含> 1個細(xì)胞和5孔不包含細(xì)胞（圖3A）。相比之下，理論接種密度為0.5個細(xì)胞/孔的有限稀釋液可實現(xiàn)30％的單細(xì)胞孔（28個），10％的多細(xì)胞孔（10個）和60％的空孔(58個）（圖3B）。圖3c顯示了單細(xì)胞打印和有限稀釋的空孔、單細(xì)胞孔和多細(xì)胞孔效率的直接比較。與有限稀釋相比，x.sight的單細(xì)胞沉積效率提高了約3倍，從而增加了用于下游分析的潛在克隆數(shù)。
克隆恢復(fù)率
隨后測試了單細(xì)胞打印產(chǎn)生的克隆的生存能力，并將它們與有限稀釋產(chǎn)生的克隆進行了比較。為了量化生存力，將來自有限稀釋或單細(xì)胞打印的微孔板定期在成像設(shè)備上成像10天，直到形成明顯的細(xì)胞團。圖4A顯示了x.sight的第10天代表性板塊中，包含大量單克隆孔（總共70孔）。圖4B中顯示了有限稀釋的第10天板，其中包含27個單克隆孔。
將來自x.sight和有限稀釋的每孔的克隆團進行計數(shù)，并分類為以下三類之一：空孔，單克隆孔和多克隆孔。觀察到有63.0％±6.5的孔包含單細(xì)胞打印產(chǎn)生的單克隆孔（其中1.5％±1.4包含多個克隆，而35.5％±7.3則不含克�。Ｍ瑫r，觀察到有限稀釋的結(jié)果是26.2％±2.3的孔包含單個克�。ㄆ渲�66.4％±3.9不含克隆，而7.4％±1.9包含多個克�。D4C繪制了來自x.sight和有限稀釋的每塊板的原始單細(xì)胞克隆。為了直接測量單細(xì)胞活力，在第0天捕獲了熒光標(biāo)記的細(xì)胞，使其生長10天。對于給定的板，通過將單克隆孔的數(shù)目（單細(xì)胞孔長起來的）除以單細(xì)胞孔的數(shù)目來獲得生存力百分比。x.sight的平均生存力為84％，而極限稀釋度則為81％。同樣，比較了來自x.sight的單細(xì)胞來源克隆對不同細(xì)胞類型的生存力（圖4E）。通常，使用CHO，HEK和其他常見細(xì)胞系時，觀察到的典型生存力大于75％。重要的是要注意，細(xì)胞活力會根據(jù)細(xì)胞類型，樣品制備，設(shè)定參數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)基和其他外部因素而變化。
圖4.單細(xì)胞打印機和有限稀釋的存活率對比（A）顯示了來自單細(xì)胞打印的第10天細(xì)胞團（綠色）。70個孔包含單個克隆團，1個孔包含2個克隆團，25個孔不包含克隆團。（B）有限稀釋平行產(chǎn)生的第10天細(xì)胞克隆團。27個孔包含單個克隆團，7個孔包含多個克隆團，62個孔不包含克隆團。（C）x.sight和有限稀釋來源的每塊板單細(xì)胞克隆率的比較。（D）比較了有限稀釋與x.sight來源的單細(xì)胞克隆的存活率。x.sight的平均生存力為84％，而有限稀釋則為81％。（E）比較了從不同類型細(xì)胞獲得的單細(xì)胞來源孔的生存力。
結(jié)論
本文展示了使用Cytena單細(xì)胞打印系統(tǒng)（x.sight）的工作流程，該工作流程可提高單細(xì)胞分離的效率并記錄單克隆性。x.sight技術(shù)為單克隆，高效，快速的單細(xì)胞接種以及出色的細(xì)胞活力以及最小的交叉污染風(fēng)險提供了基于圖像的證據(jù)。單細(xì)胞沉積效率高（> 85％），可以更全面地使用微孔板的孔來有效分離單個細(xì)胞。在此工作流程中，克隆回收率提高了3倍，這意味著可以在下游分析更多克隆，從而在提高生產(chǎn)率的同時節(jié)省了人工時間和試劑成本。
本文只是嘗試了一種細(xì)胞密度來進行單細(xì)胞的分選，根據(jù)國內(nèi)外客戶的反饋信息，調(diào)整細(xì)胞的密度進行鋪板，單細(xì)胞率和克隆生長率能分別提高到95%和91%以上（由于信息保密性，數(shù)據(jù)尚未顯示）。
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