Piggybac轉(zhuǎn)座子載體的作用原理和應(yīng)用

 

在我們研究某種疾病的發(fā)病機(jī)制或者某種藥物的作用靶點(diǎn)時(shí)，經(jīng)常需要建立目的基因過表達(dá)或基因敲除的細(xì)胞模型，目前構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及部分敲除細(xì)胞株最常用的方式之一是慢病毒法，慢病毒因其可以轉(zhuǎn)染幾乎所有種類的細(xì)胞，且在轉(zhuǎn)染后可以整合到細(xì)胞的基因組而長期表達(dá)的優(yōu)勢，是目前較為主流的構(gòu)建方法，但慢病毒構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株相對于野生型沒有生長優(yōu)勢；此外，慢病毒對目的基因的載量也有限。因此，尋找一種高效簡便可替代慢病毒法的方法顯得尤為重要。

 

轉(zhuǎn)座子的出現(xiàn)為構(gòu)建基因編輯細(xì)胞株提供了一個(gè)全新的視野。轉(zhuǎn)座子也被稱為跳躍基因，由Barbara McClintock教授在上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)，并于1983年因此發(fā)現(xiàn)而獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，是指一段DNA序列由基因組的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置。轉(zhuǎn)座子主要包含兩種類型：

☑ 一類轉(zhuǎn)座子：逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposons），自身不表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，先轉(zhuǎn)錄為RNA，通過RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，cDNA在整合酶的作用下轉(zhuǎn)移到其他基因組位置。

☑ 二類轉(zhuǎn)座子：DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposons），通過自身編碼的轉(zhuǎn)座酶直接切割轉(zhuǎn)座子所在DNA序列，實(shí)現(xiàn)序列的轉(zhuǎn)移。在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中，以睡美人轉(zhuǎn)座子（SleepingBeauty）和piggyBac轉(zhuǎn)座子等DNA轉(zhuǎn)座子最為常見。

 

睡美人轉(zhuǎn)座子是由科學(xué)家Levis于1997年在脊椎動(dòng)物中首個(gè)發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子， 其通過生物信息學(xué)方法分析8種鮭魚中12個(gè)Tc1類轉(zhuǎn)座酶序列，找出了其中的保守序列，確定了已經(jīng)滅絕的鮭魚中具有活性的轉(zhuǎn)座酶的基因序列，并稱其為睡美人轉(zhuǎn)座子。但睡美人轉(zhuǎn)座子對宿主要求嚴(yán)格，且存在轉(zhuǎn)座效率不穩(wěn)定等情況，限制了其廣泛應(yīng)用，而piggyBac轉(zhuǎn)座子則因其特異的整合位點(diǎn)、精密切割以及廣泛存在的特性被大家所青睞。

 

PiggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)與機(jī)制

PiggyBac轉(zhuǎn)座子（粉紋夜蛾）是一個(gè)2475bp長的可自主轉(zhuǎn)移元件，兩末端分別有一個(gè)由13bp和19bp的TIR序列組成的亞末端重復(fù)序列，兩端TIR序列之間的間隔分別是3bp（5’端）和31bp（3’端），在兩個(gè)亞末端重復(fù)序列之間，有一個(gè)1.8kb的開放閱讀框，編碼由594個(gè)氨基酸組成、分子量大小為64KD的PiggyBac轉(zhuǎn)座酶。如下圖所示：

 

PiggyBac屬于II類轉(zhuǎn)座子，通過“剪切-粘貼”機(jī)制移動(dòng)，即從基因組一個(gè)位置轉(zhuǎn)座到另一個(gè)位置，不留下序列本身（與I類啟動(dòng)子通過“復(fù)制-粘貼”的移動(dòng)方式不同）。

 

通過對PiggyBac超家族成員序列比對結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)PiggyBac轉(zhuǎn)座酶保守的氨基酸位點(diǎn)為D268、D346和D447，與許多其它的轉(zhuǎn)座酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的保守結(jié)構(gòu)域DDE類似，這三個(gè)位點(diǎn)參與了幾乎所有的轉(zhuǎn)座活動(dòng)，包括DNA切割、發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成和目的序列的插入。具體的整合過程如下圖所示：

 

PiggyBac轉(zhuǎn)座酶結(jié)合到轉(zhuǎn)座子DNA序列兩端，開始精確地切割每條DNA鏈轉(zhuǎn)座子DNA的3’端，形成3’-OH結(jié)構(gòu)；之后3’-OH攻擊互補(bǔ)鏈5’末端TTAA與轉(zhuǎn)座子間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致互補(bǔ)鏈DNA斷裂，釋放轉(zhuǎn)座子，同時(shí)轉(zhuǎn)座子兩端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；找到新的TTAA四堿基整合位點(diǎn)后，轉(zhuǎn)座酶伸展轉(zhuǎn)座子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，暴露3’-OH，同時(shí)3’-OH攻擊TTAA整合位點(diǎn)的5’端，形成新的磷酸二酯鍵；互補(bǔ)鏈及轉(zhuǎn)座子釋放位點(diǎn)處的單鏈缺口的修復(fù)由宿主因子完成，轉(zhuǎn)座完成。

 

PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng)組成

PiggyBac轉(zhuǎn)座子在發(fā)現(xiàn)后經(jīng)過了一系列優(yōu)化和改造的過程，如轉(zhuǎn)座酶密碼子優(yōu)化，以及兩端TIR序列的簡化，最后形成了一套完整的PiggyBac載體系統(tǒng)。PiggyBac載體系統(tǒng)成員主要有：一個(gè)輔助質(zhì)粒：編碼轉(zhuǎn)座酶；一個(gè)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒：含優(yōu)化的兩端亞末端反向重復(fù)序列，中間是被轉(zhuǎn)座區(qū)域，可插入我們想轉(zhuǎn)座到宿主基因組中的目的基因序列。

 

實(shí)驗(yàn)時(shí)需同時(shí)將輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞，輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶識(shí)別轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒兩端的TIR序列并切割，釋放的被轉(zhuǎn)座區(qū)被轉(zhuǎn)座酶整合到宿主基因組中含TTAA序列的位點(diǎn)，并在被轉(zhuǎn)座區(qū)兩端出現(xiàn)TTAA重復(fù)序列。

 

在不降低轉(zhuǎn)座效率的情況下，兩端優(yōu)化后的TIR序列間可插入10kb左右的序列，研究表明，在小鼠中通過受精卵注射的方式，用PiggyBac轉(zhuǎn)座子載體在基因組插入細(xì)菌人工染色體（BACs，150kb-300kb），轉(zhuǎn)座效率最高的達(dá)到了45%（F0代中有45%的小鼠攜帶了BACs）。

 

應(yīng)用

1. 作為非病毒載體

與傳統(tǒng)的病毒載體相比，PiggyBac具有以下幾大優(yōu)點(diǎn)：首先是安全性高、操作方便（可直接用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞）；其次是載體容量大（10kb-20kb），可實(shí)現(xiàn)多基因的共表達(dá)；第三是可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的比例，提高外源基因的整合效率，并且可通過反向PCR精確確定目的基因插入的位置；第四是再次轉(zhuǎn)座后實(shí)現(xiàn)精確切離；第五是轉(zhuǎn)座后不引起染色體重排等不穩(wěn)定現(xiàn)象；最后是宿主范圍廣，轉(zhuǎn)座效率高，較少依賴宿主因子。

 

2. 基因治療

研究表明，PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在Hela、HEK293、CHO及H1299等細(xì)胞中高效轉(zhuǎn)座，且攜帶的目的基因穩(wěn)定表達(dá)，因而是很有吸引力的基因治療候選載體之一。

 

3. 突變工具

PiggyBac再次轉(zhuǎn)座偏向插入基因內(nèi)部且插入位點(diǎn)分布較廣，可用作基因插入突變的工具，這點(diǎn)為哺乳動(dòng)物的基因組功能研究提供了較好的研究工具。

 

賽業(yè)OriCell目前已應(yīng)用PiggyBac與基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9研發(fā)而成的CRISPR-Pro技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)大片段基因敲除，與移碼突變相比，敲除更徹底，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明采用CRISPR-Pro技術(shù)更高效。相比于傳統(tǒng)病毒法構(gòu)建的細(xì)胞株，使用PiggyBac構(gòu)建的細(xì)胞株具有更高的遺傳穩(wěn)定性。賽業(yè)OriCell扎根基因敲除領(lǐng)域14年，擁有上萬例基因敲除項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，平臺(tái)成熟穩(wěn)定，目前已成功敲除細(xì)胞株種類超過198種，成功保障，安全無憂。

 

 

關(guān)于OriCell®

OriCell®是賽業(yè)生物旗下致力于干細(xì)胞試劑及干細(xì)胞技術(shù)服務(wù)的子品牌，作為擁有14年歷史的科研干細(xì)胞供應(yīng)商，OriCell®旗下?lián)碛幸?guī)模龐大、品種齊全的科研干細(xì)胞庫。自主開發(fā)了百余種干細(xì)胞及原代細(xì)胞產(chǎn)品，獨(dú)立起草的數(shù)十種科研干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)更已成為國際主要參考的干細(xì)胞技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。OriCell®干細(xì)胞及相關(guān)培養(yǎng)基已服務(wù)數(shù)萬客戶，獲得了市場占有率和滿意度的雙贏。OriCell®提供的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化服務(wù)、細(xì)胞基因編輯服務(wù)與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)已幫數(shù)千名科研人員解決了科研難題，產(chǎn)品與技術(shù)已直接應(yīng)用于包括CNS（Cell, Nature, Science）三大期刊在內(nèi)的3600余篇學(xué)術(shù)論文。如有需要，歡迎聯(lián)系我們咨詢。