組織透明化與锘海LS18在阿爾茲海默病研究中的應(yīng)用

每年的9月21日是“世界阿爾茨海默病日”。目前，全世界約有4000萬癡呆癥患者，其中大部分為阿爾茲海默�。ˋlzheimer’s Disease, 簡稱為AD）患者。我國約有1000萬AD患者，存在高患病率、低知曉率、低診斷率和低治療率的“一高三低”狀況。

 

細(xì)胞外β淀粉樣蛋白沉積和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化是AD的主要病理特征，異常的神經(jīng)活動可以加劇AD的病理發(fā)展并最終破壞與高等認(rèn)知功能相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路。反之，通過調(diào)控一些神經(jīng)活動也被證實(shí)可以減緩AD病情。2019年，來自麻省理工學(xué)院的Martorell等人在《細(xì)胞》雜志刊登的文章中【1】，使用伽馬共振感官刺激（gamma entrainment usingsensory stimuli， 簡稱為GENUS）對5XFAD阿爾茲海默病模型小鼠進(jìn)行干預(yù)。他們發(fā)現(xiàn)，聽覺GENUS使用音頻誘導(dǎo)小鼠聽覺皮層（AC）和海馬CA1區(qū)產(chǎn)生伽馬頻率的神經(jīng)活動可以促進(jìn)空間和認(rèn)知記憶，并減輕相應(yīng)區(qū)域的淀粉樣蛋白沉積。聽覺GENUS還引起相應(yīng)區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和血管擴(kuò)張反應(yīng)，并在Tau P301S小鼠模型中減少了Tau蛋白磷酸化。而同時使用40Hz的視覺+聽覺GENUS（不能只是二者之一）更進(jìn)一步地使腹內(nèi)側(cè)前額葉皮層產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)。為了更廣泛地探尋GENUS對于模型小鼠產(chǎn)生的作用，文章作者采用SHIELD方法對小鼠整腦厚切片進(jìn)行了透明化處理，通過三維光片熒光顯微整腦成像和數(shù)據(jù)分析揭示出為期一周的視覺+聽覺GENUS讓小鼠整個新皮質(zhì)中的淀粉樣蛋白負(fù)荷體積減少了37%，數(shù)量減少了34%（圖一）。GENUS這種無創(chuàng)性的干預(yù)方法在病理和行為兩方面緩解了AD模式動物的癥狀，是否能運(yùn)用于人類還有待進(jìn)一步證實(shí)。

 

圖一：經(jīng)過SHIELD透明化處理的6月齡5XFAD小鼠整腦25um矢狀面厚切片（G為無干預(yù)對照，H為視覺+聽覺GENUS干預(yù)），使用anti-Aβ plaques抗體免疫染色。

 

SHIELD透明化技術(shù)及光片熒光顯微成像技術(shù)簡介

神經(jīng)系統(tǒng)是結(jié)構(gòu)與功能最復(fù)雜的人體系統(tǒng)，成百上千種不同類型的細(xì)胞形成繁復(fù)的神經(jīng)回路與網(wǎng)絡(luò)，讓人們難以從二維切片獲取足夠的信息來進(jìn)行研究。近年來，組織透明化技術(shù)與平面光片照明顯微鏡的結(jié)合，讓完整的腦、脊髓三維成像變?yōu)榭赡堋?】。研究者利用這些技術(shù)可以更好地探索神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟、創(chuàng)傷和退變過程中的結(jié)構(gòu)與功能變化。

 

SHIELD方法【3】以保護(hù)熒光蛋白構(gòu)象為出發(fā)點(diǎn)，對主動式組織透明化技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，與采取有機(jī)溶劑的組織透明化（BABB, iDisco, uDisco, 3DISCO, vDISCO等）相比，具有更好的熒光保護(hù)效果，并且比被動式親水試劑透明化大大提高了處理速度（小鼠整腦透明化時間為3天），同時對于組織內(nèi)核酸的保留使后續(xù)免疫雜交分析成為可能。

 

與傳統(tǒng)的基于落射熒光的成像技術(shù)不同，選擇性平面照明顯微鏡（Selective plane illumination microscopy (SPIM）)將照明平面光片限制在檢測焦平面附近，通過正交的照明光路與檢測光路獲取更好、更快的三維成像能力【4】。由于光的衍射，一片薄而大，同時又具有良好光約束能力的光片只存在于理想中。因此，在面對不同的成像需求，特別是亞微米級到厘米級的多細(xì)胞大樣本成像時，空間分辨率、光學(xué)層析能力和視場大小三者不可兼得成為限制常規(guī)選擇性平面照明顯微鏡三維成像能力的根本桎梏。平鋪光片技術(shù)是一種新型的平面光片照明顯微技術(shù)，通過對空間光調(diào)制器加載不同的相位圖實(shí)現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，從而達(dá)到擴(kuò)大視場且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，并獲取在視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一的高分辨率圖像的目的【5】。利用獨(dú)特的平鋪光片技術(shù)，我們可以對經(jīng)過透明化處理的大組織（包括整腦）進(jìn)行高分辨三維成像，并對成像結(jié)果進(jìn)行三維數(shù)據(jù)渲染和分析。

 

 

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參考文獻(xiàn)：

 

【1】Martorell AJ, Paulson AL, Suk HJ, et al. Multi-sensoryGamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and ImprovesCognition. Cell. 2019;177(2):256-271.e22.

【2】Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing andits applications in neuroscience [published correction appears in Nat RevNeurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79.

【3】Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissuephysicochemical properties using polyfunctional crosslinkers [published onlineahead of print, 2018 Dec 17]. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.

【4】Gao L. Optimization of the excitation light sheet inselective plane illumination microscopy. Biomed Opt Express. 2015;6(3):881-890.

【5】Fu Q, Martin BL, Matus DQ, Gao L. Imaging multicellularspecimens with real-time optimized tiling light-sheet selective planeillumination microscopy. Nat Commun. 2016;7:11088.