利用單細(xì)胞打印機(jī)提高單克隆效率和可靠性的有效方案

單細(xì)胞的分離具有非常廣泛的應(yīng)用，抗體藥物的研發(fā)和生產(chǎn)、單細(xì)胞基因組學(xué)到細(xì)胞系的開發(fā)。然而面對(duì)單細(xì)胞克隆分離日益增長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)需求，目前常用的方法或從效率方面，或者從可靠性方面并不盡人意：傳統(tǒng)的有限稀釋法基于泊松分布，依賴于統(tǒng)計(jì)概率，工作量大且效率低下；基于流式細(xì)胞術(shù)的單細(xì)胞分選更是由于其低的細(xì)胞復(fù)蘇率而被詬病，其次儀器使用還要受累于嚴(yán)格的培訓(xùn)，繁復(fù)的清洗和維護(hù)工作。盡管如此，這兩種方法都不能從分離的過(guò)程中即得到單細(xì)胞來(lái)源的證明，只能單純依賴孔板掃描成像設(shè)備對(duì)結(jié)果拍照以后才能獲得克隆單細(xì)胞來(lái)源證據(jù)。

Cytena Single-Cell Printer是一款非常高效的單細(xì)胞分離設(shè)備，通過(guò)Cytena SCP分離單細(xì)胞不僅能夠有高的單細(xì)胞獲得率，獲得的單細(xì)胞的生長(zhǎng)率也非常高，儀器通過(guò)優(yōu)異的光學(xué)系統(tǒng)，能夠?qū)γ總�(gè)成功被獲得的單細(xì)胞在分離的過(guò)程中跟蹤拍照，留下單細(xì)胞來(lái)源的證據(jù)，結(jié)合孔板掃描設(shè)備成像結(jié)果，相互佐證單細(xì)胞來(lái)源，可以使單細(xì)胞可靠性高達(dá)99.9%。機(jī)器使用一次性的耗材，免去了大量的清洗和驗(yàn)證工作，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜維護(hù)。

下文中介紹了一種單細(xì)胞打印機(jī)結(jié)合孔板成像的實(shí)驗(yàn)流程，實(shí)驗(yàn)中使用有限稀釋法作平行對(duì)照，證明儀器的高效可靠性。

材料和方法：

樣品準(zhǔn)備：
指數(shù)生長(zhǎng)期的CHO-K1 細(xì)胞 (來(lái)源于ATCC)，輕柔離心去除培養(yǎng)基后，重懸于無(wú)菌PBS溶液中，密度調(diào)整為1x10⁶cell/mL，為避免細(xì)胞團(tuán)塊兒，在上樣至打印芯片前，通過(guò)40um篩網(wǎng)過(guò)濾(其他類型細(xì)胞處理方法相同)。

Cytena SCP單細(xì)胞打印分離：
上樣：取準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣品60ul加入一次性無(wú)菌打印芯片中，芯片安裝好即可以啟動(dòng)打印過(guò)程。
參數(shù)設(shè)定：在開始打印前可以設(shè)定目標(biāo)單細(xì)胞的圓度，直徑 和熒光信號(hào)強(qiáng)度范圍（F.sight），因?yàn)闉l死細(xì)胞或不健康細(xì)胞的直徑和圓度通常會(huì)發(fā)生變化，此功能能夠提高獲得優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞的概率（見圖1）。如果對(duì)細(xì)胞的大小圓度或者熒光強(qiáng)度不熟悉，儀器還提供樣品數(shù)據(jù)收集分析功能，可以簡(jiǎn)單快速的獲得樣品數(shù)據(jù)的分布情況，以指導(dǎo)設(shè)置合適的參數(shù)區(qū)間。
 

                                                                              圖1

圖2

單細(xì)胞分離：儀器使用獲得專利的類似噴墨的柔和分液系統(tǒng)產(chǎn)生均勻液滴，使用雙攝像頭系統(tǒng)分別對(duì)液滴進(jìn)行質(zhì)控和液滴中的細(xì)胞進(jìn)行甄選（F.sight 中的熒光檢測(cè)的功能可以對(duì)液滴中細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)），快速分離到符合要求的單細(xì)胞（圖2）至鋪有克隆培養(yǎng)基的384孔板中（儀器也支持96孔板）。
分離的單細(xì)胞來(lái)源證據(jù): 在對(duì)細(xì)胞分離篩選的過(guò)程中，對(duì)于每一個(gè)被獲得的單細(xì)胞，在其靠近噴嘴區(qū)，系統(tǒng)確認(rèn)單細(xì)胞事件，即對(duì)其進(jìn)行靠近-進(jìn)入ROI區(qū)域-通過(guò)噴嘴區(qū)的過(guò)程進(jìn)行跟蹤拍照，留下單細(xì)胞源證據(jù)（圖3）。后續(xù)多孔板在經(jīng)過(guò)孔板成像設(shè)備掃描成像后可以與此圖片證據(jù)相互佐證，驗(yàn)證單細(xì)胞的準(zhǔn)確性。

                                                                         圖3
有限稀釋對(duì)照：
取準(zhǔn)備好的細(xì)胞樣品，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，使用克隆培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋，接種密度為0.3cell/孔，在384孔板中接種80ul細(xì)胞稀釋液。

結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析：

使用多孔板成像設(shè)備在Day0拍照統(tǒng)計(jì)單細(xì)胞打印機(jī)分離獲得的單細(xì)胞率數(shù)據(jù)，之后進(jìn)行跟蹤拍照至7天后肉眼可見的克隆團(tuán)出現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)單克隆生長(zhǎng)率。

單細(xì)胞率：
使用同一個(gè)打印芯片，分了兩個(gè)384孔板，平均的單細(xì)胞率為92.6%，兩細(xì)胞孔和空孔率分別為5.0% and 0.4%（見圖4）,分完每板所用的時(shí)間平均為20min。
 

                                                                          圖4
克隆生長(zhǎng)率：
分離得到的單細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)能力是很關(guān)鍵的數(shù)據(jù)，體現(xiàn)細(xì)胞在經(jīng)過(guò)分離過(guò)程以后的活力情況，可以驗(yàn)證分離的方法是否對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了負(fù)面影響，有限稀釋法被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞的影響最小的單細(xì)胞分離方法。單細(xì)胞打印機(jī)分選的細(xì)胞生長(zhǎng)情況（圖5A）：326個(gè)孔含有單細(xì)胞克隆，5個(gè)孔是兩個(gè)細(xì)胞來(lái)源的克隆，32個(gè)孔沒(méi)有細(xì)胞。有限稀釋法的多孔板鋪板后生長(zhǎng)到第7天的克隆生長(zhǎng)情況（圖5B）：44個(gè)孔是單細(xì)胞克隆孔，6個(gè)孔是多個(gè)細(xì)胞的克隆孔，334孔是空細(xì)胞孔。單細(xì)胞打印機(jī)分離的單克隆生長(zhǎng)率高達(dá)84.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平行的有限稀釋法（10.5%）（分裂生長(zhǎng)的單克隆數(shù)/總的單細(xì)胞孔數(shù)*100%）。

                                                                        圖5
結(jié)論：
通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，Cytena單細(xì)胞打印機(jī)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的高效分離，獲得高的單細(xì)胞率，且分選過(guò)程對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。通過(guò)軟件對(duì)相關(guān)參數(shù)設(shè)定，篩選出狀態(tài)好的細(xì)胞，來(lái)確保后期的高克隆生長(zhǎng)率，同時(shí)分離過(guò)程留下單細(xì)胞來(lái)源證據(jù)，非常適合細(xì)胞系的開發(fā)工作，提高工作效率。


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