IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯的兩種不同編輯實(shí)驗(yàn)流程的應(yīng)用

IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)
 
IDT（Integrated DNA Technologies）作為核酸定制合成領(lǐng)域的知名企業(yè)，依托30年來(lái)的技術(shù)研發(fā)，推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產(chǎn)品，通過(guò)對(duì)gRNA序列、Cas9核酸酶優(yōu)化，對(duì)RNP轉(zhuǎn)染效率、同源重組修復(fù)HDR效率的提升，形成了從crRNA設(shè)計(jì)到CRISPR編輯結(jié)果檢測(cè)的一站式解決方案，讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)更高效、更簡(jiǎn)單。

 
Alt-R® CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng)，分別對(duì)crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進(jìn)行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾，對(duì)化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過(guò)電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）轉(zhuǎn)染RNP，可進(jìn)行精確地基因編輯操作。
 
傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas9質(zhì)粒的方法，質(zhì)粒大小高達(dá)6-10kb，很難轉(zhuǎn)染，而如使用原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法，通過(guò)優(yōu)化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上，提高轉(zhuǎn)染效率、減少細(xì)胞毒性、降低脫靶，進(jìn)而提高了基因編輯效率。

 
Alt-R® CRISPR-Cas9實(shí)驗(yàn)流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)Alt-R® crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補(bǔ)，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合，通過(guò)crRNA的重復(fù)序列區(qū)（Repeats）與tracrRNA堿基配對(duì), 形成向?qū)�RNA（guide RNA，簡(jiǎn)稱(chēng)gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡(jiǎn)稱(chēng)RNP)；
4、將RNP通過(guò)電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核；
5、通過(guò)crRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列，通過(guò)Cas9蛋白識(shí)別PAM序列（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡(jiǎn)稱(chēng)PAM），對(duì)DNA進(jìn)行剪切；
6、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining，簡(jiǎn)稱(chēng)NHEJ），實(shí)現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設(shè)計(jì)工具）設(shè)計(jì)供體DNA模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)（Homology directed repair，簡(jiǎn)稱(chēng)HDR），實(shí)現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。

 
 
【方法二】
1、（用IDT工具）設(shè)計(jì)sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補(bǔ)，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過(guò)電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核；
4、通過(guò)sgRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列，通過(guò)Cas9蛋白識(shí)別PAM序列，對(duì)DNA進(jìn)行剪切；
5、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因敲除；
②（用IDT工具）設(shè)計(jì)供體DNA模板，進(jìn)行同源重組修復(fù)，實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。
 

 
 
 
Alt-R® crRNA序列設(shè)計(jì)示意圖

 
Alt-R® CRISPR-Cas9相關(guān)：
1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細(xì)胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
 
2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，經(jīng)其他化學(xué)修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn)，可提高編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。
 
3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個(gè)RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經(jīng)化學(xué)修飾，穩(wěn)定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn)。相比體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA，減少細(xì)胞免疫反應(yīng)，更小細(xì)胞毒性。
 
4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經(jīng)化學(xué)修飾，具有核酸酶抗性�？商峁�熒光標(biāo)記，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。

圖.穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染Alt-R® crRNA(未標(biāo)記):tracrRNA(標(biāo)記)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，熒光顯微鏡下10倍放大。
 
5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene來(lái)源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標(biāo)簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，經(jīng)序列優(yōu)化，提高中靶率，降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
 
6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene來(lái)源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域功能失活，對(duì)DNA靶向鏈進(jìn)行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH結(jié)構(gòu)域失活，對(duì)非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
 
7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene來(lái)源Cas9，大腸桿菌表達(dá)純化，喪失內(nèi)切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進(jìn)行基因下調(diào)（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近才能發(fā)揮功能，其脫靶率遠(yuǎn)低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
 
8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer：是Cas9特異性的載體DNA，當(dāng)使用原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備對(duì)RNP的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而提高基因編輯效率。
 
9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細(xì)胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
 
10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸：專(zhuān)門(mén)為同源重組修復(fù)基因敲入開(kāi)發(fā)，具有比標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率，可同時(shí)用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
 
 
Alt-R® CRISPR-Cas9實(shí)例分析
1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長(zhǎng)度，提高編輯性能

以HPRT基因中的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后，通過(guò)二代測(cè)序檢測(cè)總的編輯效率，結(jié)果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。
 
2、化學(xué)修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性

以HPRT1的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）RNA，轉(zhuǎn)染可高效表達(dá)化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞，24小時(shí)后，測(cè)定常見(jiàn)應(yīng)激反應(yīng)基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達(dá)水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFIT1，而Alt-R® RNA無(wú)影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對(duì)OAS2的誘導(dǎo)可測(cè)，而Alt-R® RNA處于基線(xiàn)。同時(shí)IFITM1、RIGI、OAS1等3個(gè)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因均得到相似結(jié)果，說(shuō)明Alt-R® RNA不會(huì)激活細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。
 
3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特異性切割
 
4、電穿孔Enhancer，提高轉(zhuǎn)染效率，尤其是原代細(xì)胞等較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復(fù)合體），通過(guò)Lonza Nucleofector 核轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞（A）、Jurkat細(xì)胞（B）、HEK-293細(xì)胞（C）時(shí)，使用電穿孔Enhancer（深藍(lán)色）、不使用（淺藍(lán)色）的編輯效率。
 
5、HDR Enhancer，提高同源重組修復(fù)效率
①提高多種細(xì)胞HDR

以人HPRT為靶點(diǎn)，使用Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝），加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復(fù)DNA模板，轉(zhuǎn)染人多種細(xì)胞系。電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基中（綠色），或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照（棕色），HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時(shí)，Jurkat、K562培養(yǎng)72小時(shí)，通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、靶序列PCR進(jìn)行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細(xì)胞類(lèi)型的同源重組修復(fù)效率。
 
②提高多種基因HDR
）
以人基因組多個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn)，將4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基（藍(lán)色）、含有DMSO的培養(yǎng)基（綠色）、未處理的培養(yǎng)基（棕色），48-72小時(shí)后，通過(guò)RFLP、PCR進(jìn)行HDR分析，顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
 
6、在線(xiàn)CRISPR序列設(shè)計(jì)工具，方便地設(shè)計(jì)高質(zhì)量的crRNA/sgRNA/同源重組修復(fù)DNA模板/引物等
 
如物種的基因組富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點(diǎn)不適合，IDT同時(shí)提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，盡可能滿(mǎn)足編輯需求。
 
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——IDT中國(guó)一級(jí)代理商，北京澤平