多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT在單細胞力學實驗中的創(chuàng)新應用

       瑞士Cytosurge公司的多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、納米位移臺系統(tǒng)合為一體的單細胞操作系統(tǒng)，能夠在單細胞水平上為研究者提供很大的便利，可應用于單細胞力譜、單細胞質(zhì)譜、單細胞基因編輯、細胞系構(gòu)建、藥物研發(fā)、醫(yī)療等領(lǐng)域。本文將從單細胞實驗方法和多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT結(jié)構(gòu)出發(fā)，詳細介紹多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT在單細胞力學實驗中的應用。

一. 單細胞實驗方法簡介
在細胞生物學實驗中，由于細胞的異質(zhì)性，每個細胞互相之間都存在一定差異，因此在單細胞層面研究細胞性質(zhì)可以獲得更加準確的結(jié)果。近年來，多種單細胞研究技術(shù)不斷涌現(xiàn)，應用于醫(yī)學診斷、組織工程和藥物篩選等領(lǐng)域。

       對于細胞力學測定，原子力顯微鏡（AFM）能夠?qū)�單個細胞或生物分子進行高分辨成像和力譜測定，但是細胞與探針的結(jié)合過程不可逆，無法實現(xiàn)連續(xù)、快速的檢測。

       對于細胞分離/分選技術(shù)，可選的有玻璃細管、光鑷、流式細胞分選和磁珠分選等方法，然而有的從表面分離細胞時容易損傷細胞，有的無法從同類細胞群中分離出單個細胞。

       對于細胞注射與提取，可選用納米噴泉探針、納米針和碳納米管等，然而這些方法無法實現(xiàn)飛升以下量級的含量注射，且注射時間較長。

       多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT，針對細胞力學測量、分離/分選、注射與提取等應用，在結(jié)合以上技術(shù)的優(yōu)勢的同時克服了這些技術(shù)固有的問題，是一套多功能的單細胞研究系統(tǒng)，在單細胞研究領(lǐng)域發(fā)揮著巨大作用。

二. 多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT結(jié)構(gòu)
簡單來說，多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT是AFM與微流控的結(jié)合，主要由AFM掃描頭、壓力控制器與微流控探針組成（圖1）。AFM掃描頭裝載于倒置顯微鏡上，整體結(jié)構(gòu)大致與普通AFM相同，主要區(qū)別是探針中間有微流通道，后端連接液體池，前端探針有一小孔，用于液體的流入流出。微流通道內(nèi)徑小于細胞，防止細胞進入堵塞；探針則有多種不同孔徑和不同的彈性，可根據(jù)不同應用以及不同樣本更換所需探針。
 

圖1 FluidFM BOT系統(tǒng)圖示。（a）微流控系統(tǒng)與AFM的結(jié)合應用；（b）（c）（d）探針的特殊設(shè)計。

三. 單細胞力學應用
傳統(tǒng)AFM用于單細胞力學測量時，需要對探針進行一定處理以粘附細胞，后再與需要和細胞相互作用的表面、分子或其他細胞相結(jié)合，有時會產(chǎn)生多個細胞粘附，且反復測力會導致細胞被破壞，使得每次測量都必須準備新的探針，實驗效率較低。

多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT通過將AFM與微流控相結(jié)合，使單細胞力學實驗更高效，更簡潔。對于已經(jīng)結(jié)合在表面的固定細胞，可根據(jù)細胞尺寸安裝適用的探針，從上方接觸需要測量的細胞，通過微流控系統(tǒng)施加負壓吸起細胞，獲得力-距離曲線；也可以吸取懸浮細胞，與表面或其他固定細胞接觸后，測量力-距離關(guān)系。這種方法能夠提供遠比蛋白結(jié)合牢固的多的吸附力，能夠?qū)⒓毎�牢固的固定在探針上面，因此能夠用于直接從基質(zhì)上分離；另一方面，由于沒有生物處理，這種方法不會改變?nèi)魏渭毎�表面的通路，從而能夠得到接近細胞原生的�?shù)據(jù)。

單個細胞測量完成后可移動探針至細胞板其他孔內(nèi)，施加正壓將其釋放，再回到實驗孔吸取下一個細胞，意味著單個探針可以進行多次測量。

細胞粘附是許多生理過程的重要步驟，細胞粘附力的測定可以為組織形態(tài)發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤、免疫反應和微生物膜等研究提供重要信息。多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT支持真核和原核細胞與細胞板/培養(yǎng)皿表面、抗菌/粘性/抗體包被的表面或其他細胞的粘附力測量（圖2）。
 

圖2 不同細胞在不同環(huán)境下的粘附力-距離曲線。（a）探針接近、暫停、吸取并拉伸細胞的過程中探針偏轉(zhuǎn)隨時間的變化；（b）Hela細胞與纖連蛋白包被的表面的粘附力-距離曲線；（c）不同接觸時間下大腸桿菌與PLL表面的粘附力-距離曲線；（d）大腸桿菌與PLL表面的分離距離與接觸時間的關(guān)系；（e）釀膿鏈球菌與玻璃表面的粘附力-距離曲線，表示多個球菌的連續(xù)分離；（f）單個細胞與單細胞層的粘附力-距離曲線。

Sankaran等人^[1]使用多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT來研究在共價和非共價的表面整合素受體對細胞粘附力的影響。通過測定發(fā)現(xiàn)兩者均可有效增加細胞的粘附能力，并且效果近似（圖3）。
 

圖3使用FluidFM BOT測定共價鍵與非共價鍵的整合素受體之間RGD的區(qū)別。（a）實驗示意圖；（b）粘附力測定前后示意圖；（c）粘附力-距離曲線；（d）最大粘附力。

多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT還可用于測量細胞的應力以研究細胞骨架的性質(zhì)。Sancho等人^[2]將10μm的小膠球吸附于探針上，之后使用探針去壓細胞直到探針壓力達到2 nN，通過壓痕曲線來分析細胞骨架變化。通過對比發(fā)現(xiàn)過量表達MSX1的細胞硬度顯著高于普通細胞（圖4）。
 

圖4 使用FluidFM BOT測定HUAEC中MSX1過表達對細胞骨架的影響。（d）實驗示意圖；（e）吸附10μm珠子；（f）下壓時空白細胞的力學譜線；（g）下壓時MSX1過表達細胞的力學譜線，凹陷更深、斜率更高，表示其剛度相對更高；（h）膠體壓痕法的測量結(jié)果。

四. 其他應用
多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT可用于細胞內(nèi)注射與提�。▓D3），通過力學測量，可以控制探針刺入細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)進行飛升級別含量的液體注射或提取。此外，F(xiàn)luidFM BOT系統(tǒng)還可用于細胞分離以及細胞延展性研究。
 

圖5 FluidFM BOT系統(tǒng)的細胞內(nèi)注射過程。（a）探針對準細胞；（b）探針刺破細胞膜，注入含熒光染料的目標液體；（c）探針與細胞分離，注射完成。

多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT克服了現(xiàn)有單細胞技術(shù)的短板，將多種單細胞應用相結(jié)合，高通量、高效率地獲取單細胞層面的詳細數(shù)據(jù)，研究多種細胞性質(zhì)，尤其適合應用于醫(yī)療、單細胞生物學、單細胞質(zhì)譜、單細胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

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參考文獻：

[1]. Cell Adhesion on Dynamic Supramolecular Surfaces Probed by Fluid Force Microscopy-Based Single-Cell Force Spectroscopy, ACS Nano 2017, 11, 4, 3867–3874.

[2]. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci Rep 7, 46152 (2017).

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