應(yīng)用案例｜活體近紅外二區(qū)聚甲川熒光染料多色融合成像

 

圖1:紅外二區(qū)活體成像：多色熒光融合技術(shù)

 

熒光成像技術(shù)使得人類對細(xì)胞和微生物的研究能力得到革命性提升，高分辨率多路復(fù)用技術(shù)是細(xì)胞成像的主要手段，然而將該技術(shù)應(yīng)用于哺乳動物身上卻有很大挑戰(zhàn)性，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的熒光成像激發(fā)光位于可見光區(qū)域（VIS,350-700nm），而哺乳動物組織在可見光區(qū)域以及近紅外一區(qū)（NIR-I,700-1000nm）有較大的散射和自體熒光。在近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000-1700nm），動物組織光散射與自體熒光大大減少，同時成像深度隨波長增加而增加，因此極大提高了成像的空間分辨率。本文作者選擇吸收和發(fā)射帶較窄的花菁染料（Flav）進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，開發(fā)出11個含有不同取代基的染料（如下圖1a），采用與傳統(tǒng)多路復(fù)用使用同一激發(fā)波長不同檢測窗口相反的方式，作者采用了不同激發(fā)波長去激發(fā)相匹配的化合物，使用一個InGaAs檢測器來接收信號的方式避免了傳統(tǒng)方法多通道檢測導(dǎo)致分辨率差異的問題。通過從11個化合物中篩選出兩個性能最好的染料分別匹配980nm和1064nm的激發(fā)波長，結(jié)合臨床已批準(zhǔn)使用的吲哚菁綠（ICG），本文作者實(shí)現(xiàn)了實(shí)時、三色的高時空分辨成像。

 

圖2：a）不同取代基取代的黃酮類花菁染料；b）和c）分別為對應(yīng)化合物的吸收與發(fā)射圖譜。

 

首先作者選擇了980nm和1064nm的激光，一方面是因?yàn)檫@些激光器成本低容易獲得，另一方面多通道檢測要求兩個通道之間至少間隔80nm的波長范圍。通過比較作者選擇了化合物3（JuloFlav7）用于匹配1064nm激發(fā)，化合物10（MeoFlav7）用于匹配980nm激發(fā)，ICG則使用785nm的光激發(fā)。為了實(shí)現(xiàn)實(shí)時成像，將毫秒級的觸發(fā)信號獨(dú)立發(fā)送到每個連續(xù)波激光器，并對探測器進(jìn)行編程，為每一個序列的激發(fā)脈沖收集單一幀。作者將化合物3和化合物10用聚乙二醇膠束促溶，分別對比了在有機(jī)相和水相的三色成像，發(fā)現(xiàn)被膠束促溶后的探針并不影響成像效果。隨后作者在小鼠體內(nèi)腹腔注射MeoFlav7，2min后靜脈注射JuloFlav7，最后在4min時注射ICG，如圖2g所示，實(shí)時多色成像顯示出了不同探針在小鼠體內(nèi)不同部位的相對分布。

 

圖3：e）三種探針在有機(jī)相（上）和水相（中）以及線性分離矯正的三色成像；f）注射三種探針的時間線；g）使用785、980和1064 nm激發(fā)波長激發(fā)和1150-1700 nm范圍采集（10ms曝光時間，27.8 fps）的體內(nèi)多路復(fù)用圖像。

 

隨后作者探索了實(shí)時近紅外多色成像的應(yīng)用。心跳速率、呼吸速率、溫度調(diào)節(jié)、代謝以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能受麻醉的影響甚大，觀測動物的自然狀態(tài)對研究生理學(xué)是必須的，目前僅限于遙感裝置和心電圖以及植入裝置等手段�？焖貼IR-II實(shí)時成像使得無接觸觀測蘇醒小鼠的生理狀態(tài)得以實(shí)現(xiàn)。由于幀速率比動物的宏觀運(yùn)動更快，因此可以量化清醒動物的心率和呼吸速率。在腹腔注射MeOFlav7和連續(xù)靜脈注射JuloFlav7和ICG的80分鐘后進(jìn)行清醒的小鼠成像。如下圖3a所示，可以在3.2s內(nèi)看到小鼠的頭部的移動軌跡變化，同時通過量化感興趣區(qū)域肝臟的運(yùn)動測量出小鼠的心率為247/min（圖3b）。隨后作者利用兩個探針I(yè)CG和JuloFlav7在肝臟的積累與分布來評估兩個探針的生物分布和清除特性，如圖3c和d所示，ICG一小時內(nèi)信號逐漸降低，而JuloFlav7的信號基本保持不變。

 

圖4：a）三色多路復(fù)用成像；b）清醒小鼠的心率測量；c）JuloFlav7系統(tǒng)標(biāo)記ICG清除成像；d）1h內(nèi)的ICG與JuloFlav7的信號百分率；e）雙色活檢成像

 

熒光成像引導(dǎo)的手術(shù)過程中，區(qū)分與癌癥有關(guān)的前哨淋巴結(jié)和評估淋巴血管疾病中淋巴網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能對癌癥治療極為重要。本文作者預(yù)先在小鼠足和尾巴皮下注射ICG，40min后ICG聚集在淋巴系統(tǒng)中，隨后JuloFlav7膠束靜脈注射并立即成像，如圖4所示，可以看到在30s左右JuloFlav7顯示出大多數(shù)血管，與淋巴組織區(qū)別開來。這種鑒別淋巴和循環(huán)系統(tǒng)并同時監(jiān)測其功能的能力在非侵入性診斷和擴(kuò)大熒光引導(dǎo)手術(shù)方面具有非凡的意義。

 

圖5：a）注射不同探針的時間線；b）注射JuloFlav7膠束30s后的成像；c）不同時間點(diǎn)的局部放大圖片

 

參考文獻(xiàn)：
Cosco E D, Spearman A L, Ramakrishnan S, et al. Shortwave infrared polymethine fluorophores matched to excitation lasers enable non-invasive, multicolour in vivo imaging in real time[J]. Nature Chemistry, 2020, 12(12): 1123-1130.

⭐ ⭐ ⭐

紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 獨(dú)家定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀