BLT小課堂 | 螢火蟲螢光素酶在ATP檢測中的應(yīng)用

前言：
生物發(fā)光是一種在生物體內(nèi)由酶將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的現(xiàn)象，在自然界中有超過30種生物發(fā)光體系，而我們所熟知的螢火蟲的發(fā)光體系就是其中研究最早，應(yīng)用也最廣泛的一種。螢火蟲的發(fā)光現(xiàn)象是由其體內(nèi)的螢光素酶（luciferase）的催化下三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)與發(fā)光底物螢光素（lucierin）發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光。

ATP被認(rèn)為是一種在所有生物體生存和繁殖的細(xì)胞合成中必不可少的普遍能量來源，形象的說，它是一種通用的能量“貨幣”。ATP可以通過水解產(chǎn)生AMP和一個(gè)磷酸基團(tuán)，同時(shí)釋放出能量，供給細(xì)胞活動(dòng)。
 

ATP結(jié)構(gòu)圖

發(fā)光反應(yīng)的方程式：

研究歷史：
1885年螢光素及螢光素酶第一次被Dubois提取出來；1952年Strehler和Totter首次使用螢光素酶粗制品測定ATP；1961年White等人工合成了螢光素；1985年Dewet, JR等首次克隆了P. Pyralis螢光素酶基因并在大腸桿菌中表達(dá)，從中得到具有活性的螢光素酶，從而開啟了螢光素酶作為報(bào)告基因的歷程。

ATP的含量直接反應(yīng)了細(xì)胞或微生物的含量，通過監(jiān)測ATP含量的改變，可以評(píng)價(jià)多種藥物、生物制劑或生物活性物質(zhì)引起的細(xì)胞殺傷、細(xì)胞抑制和細(xì)胞增殖作用；另外ATP也常作為微生物污染的一個(gè)指標(biāo)，檢測ATP含量能直接反映出其受污染程度。測定生物體中ATP的水平及其動(dòng)態(tài)變化便成為監(jiān)測生物體必不可少的手段。接下來，小編將向大家具體介紹一下他在近年來的應(yīng)用領(lǐng)域。
 

<應(yīng)用領(lǐng)域>

01
食品安全
人類的身體健康、生命安全長期受到微生物污染的威脅，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法是國際上針對(duì)微生物檢測的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法，然而該方法要求在 37 ℃下持續(xù)培養(yǎng) 48 h，過于繁瑣的操作無法實(shí)現(xiàn)快速檢測�，F(xiàn)下，國內(nèi)也加大了對(duì)核酸法、電阻抗測量、免疫學(xué)方法、微菌落技術(shù)等各類微生物快速檢測技術(shù)展開了研究、應(yīng)用。ATP生物發(fā)光法因快速、簡便且具有較高靈敏度的緣故，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)控微生物污染，與食品行業(yè)需求相符合，故而有關(guān)該技術(shù)的研究與應(yīng)用十分廣泛。

其檢測步驟通常為：
①首先根據(jù)ATP發(fā)光檢測試劑盒的使用說明將標(biāo)準(zhǔn)ATP按梯度稀釋，與酶、底物、緩沖液按比例混合，使用發(fā)光檢測設(shè)備（比如博鷺騰發(fā)光檢測系列）測量對(duì)應(yīng)的發(fā)光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
②提取樣品細(xì)胞中的ATP，稀釋，之后按比例與酶、底物、緩沖液混合，使用發(fā)光檢測設(shè)備測定發(fā)光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可知道樣品中ATP濃度。（ATP濃度與細(xì)胞濃度關(guān)系的測定：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，離心濃縮后用苔盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，之后在 96孔培養(yǎng)板上等比稀釋，測定其發(fā)光值，發(fā)光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得ATP濃度，經(jīng)過計(jì)算即可獲得ATP濃度與細(xì)胞濃度關(guān)系。）

應(yīng)用案例：

酒類制作過程中微生物濃度檢測		食品生產(chǎn)線衛(wèi)生學(xué)檢測
環(huán)境保護(hù)部門水體微生物檢測		衛(wèi)生監(jiān)管部門微生物數(shù)量檢測

對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)：
[1]吳慧清.ATP生物發(fā)光法飲用水中細(xì)菌總數(shù)快速測定方法研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(9):1975-1978.
[2]劉陽,牟金明.ATP生物發(fā)光法快速測定物體表面的菌落總數(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(1):125-128.
[3]易琳.微生物檢測中 ATP 生物發(fā)光法的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].生物化工,2019,5(1):124-126.
[4]高紅閣.ATP 生物熒光法在衛(wèi)生監(jiān)督工作中的應(yīng)用進(jìn)展[J].疾病監(jiān)測與控制雜志,2013,7(9):548-550.
[5]伍季.ATP生物發(fā)光法快速檢測啤酒中的菌落總數(shù)[J].河南科學(xué),2006,24(1):63-65.
[6]李春艷,霍貴成.ATP生物發(fā)光法快速測定生乳中微生物總數(shù)的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(7):233-238.
[7]魏樹源.三磷酸腺苷生物發(fā)光快速微生物檢測法在疫苗中間品無菌試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國生物制品學(xué)雜志,2010,23(10):1120-1124.
[8]叢苑,李平蘭.ATP 發(fā)光法快速檢測玉米中的霉菌[J].中國食品學(xué)報(bào),2014,14(8):233-238. 基本思路為：
①將癌細(xì)胞與藥物體外混合培養(yǎng)一段時(shí)間。
②與食品安全檢測類似：繪制發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線→測定與藥物混合培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)光值→代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計(jì)算出藥物對(duì)腫瘤的殺傷強(qiáng)度。

應(yīng)用案例：

化療藥物篩選		結(jié)核藥物篩選
細(xì)胞活性測定		中醫(yī)療效評(píng)價(jià)

       

對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)：
[1]周旻.ATP生物發(fā)光法檢測卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[J].廣東醫(yī)學(xué),2000,21(4):293-295.
[2]陳歷排.用微量板 ATP生物發(fā)光法檢測腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[J].腫瘤,2000,20(2):103-105.
[3]劉君.三磷酸腺苷發(fā)光法快速檢測結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,41(1):108-113.
[4]梁鎮(zhèn)興.利用自主發(fā)光結(jié)核分枝桿菌快速連續(xù)檢測抗結(jié)核藥物的細(xì)胞內(nèi)活性[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(23):3823-3826.
[5]張志敏.ATP釋放法測定人外周血NK細(xì)胞活性及初步臨床應(yīng)用[J].免疫學(xué)雜志,1992,8(4):260-261.
[6]湛學(xué)軍.三磷酸腺苷生物發(fā)光法分析莪術(shù)油等中藥抑制肝、胃癌細(xì)胞增殖活性的研究[J].江西醫(yī)藥,2005,40(11):706-708.
[7]朱云仙.養(yǎng)心2號(hào)方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織ATP及MMP的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,32(3):274-278.
[8]彭艷.艾灸對(duì)脾虛大鼠空腸組織ATP含量和ATP酶活性的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(1):8-13.

 

高靈敏度板式發(fā)光檢測儀Lux-P110：目前已被多家學(xué)校、醫(yī)院、企業(yè)所使用，具有極高的靈敏度（≤10amolATP或≤20zmol 螢光素酶）、超寬的線性范圍（≥6個(gè)數(shù)量級(jí)），同時(shí)配備了兩個(gè)原位進(jìn)樣器，支持雙螢光素酶報(bào)告體系的檢測。
 

 

高靈敏度管式發(fā)光檢測儀Lux-T020：管式發(fā)光檢測儀主要針對(duì)單樣品發(fā)光檢測的客戶，相比于Lux-P110，體積更加小巧，使用更加方便，靈敏度則與Lux-110相同。該系列設(shè)備支持試用，歡迎您與我們聯(lián)系。