蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）常見問題解析
蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
WB實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)各種問題，得到不完美的結(jié)果。西美杰代理的SeraCare（KPL）品牌做為世界知名免疫學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商擁有近40年的產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗，對WB實驗有一定深入的了解，今天就為廣大客戶分享和總結(jié)WB中常見問題和解決辦法。
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問題 |
可能原因 |
解決辦法 |
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轉(zhuǎn)膜不充分導(dǎo)致信號較弱 |
膜沒有完全均勻濕透 |
使用100%甲醇浸透膜 |
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靶蛋白分子量小于10000 |
選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間 | |
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靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液PH值 |
嘗試使用其他緩沖液 | |
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甲醇濃度過高 |
降低甲醇濃度或者使用乙醇/異丙醇替代 | |
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轉(zhuǎn)移時間不夠 |
對于厚的膠以及高分子量蛋白質(zhì)需要延長轉(zhuǎn)移時間 | |
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洗膜不充分 |
增加洗液體積和洗滌次數(shù) | |
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阻斷不充分 |
增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。 | |
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二抗?jié)舛?/SPAN>過高 |
降低二抗?jié)舛?/SPAN> | |
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檢測過程中膜干燥 |
保證充分的反應(yīng)液 | |
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曝光過度 |
縮短曝光時間 | |
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抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) |
檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) | |
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沒有陽性條帶或條帶信號較弱 |
抗體染色不充分 |
增加抗體濃度，延長孵育時間 |
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酶活降低甚至失活 |
直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)，有活性的酶聯(lián)物 | |
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標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 |
設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低�？煽紤]增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 | |
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試劑不匹配 |
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性 | |
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一抗失效 |
選擇在有效期內(nèi)抗體，并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 | |
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洗膜過度 |
縮短洗滌時間 | |
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HRP抑制劑 |
所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉 | |
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抗體活性降低 |
選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置 | |
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蛋白轉(zhuǎn)移不充分 |
見上述 | |
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封閉過度 |
減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型 | |
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曝光時間過短 |
延長曝光時間 | |
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條帶位置（大�。┎粚Γ蛴蟹翘禺愋詶l帶 |
二抗的非特異性結(jié)合 |
增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
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一抗的特異性不夠 |
使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
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蛋白降解 |
使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑，實驗中增加內(nèi)參 | |
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蛋白二聚體或多聚體存在 |
增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 | |
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抗體濃度過高 |
降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶 | |
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蛋白上樣量過大 |
降低樣本上樣量 | |
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背景斑駁 |
封閉劑中有聚集體 |
使用前過濾封閉劑 |
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HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 |
過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
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膜上出現(xiàn)反像 |
HRP含量過高 |
降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
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