細(xì)菌內(nèi)毒素檢測常見問題解答（一）：如何溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品等
在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的過程中，技術(shù)人員常面臨各種挑戰(zhàn)與疑問，為解決這些問題，科德角國際匯總了客戶咨詢的常見問題，并以詳盡的問答形式提供了指導(dǎo)性的解答，為相關(guān)從業(yè)者提供參考。
一、如何溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品？
對于不同類型的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，其溶解方法有所不同。
▶▶美國藥典USP細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（USP-RSE）：加入5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水（2000EU/mL），再劇烈渦旋30分鐘。
▶▶科德角國際歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（BRP）：將5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水添加到小瓶中。使用渦旋混合器間歇混合30分鐘以復(fù)溶，以獲得初始濃度2000EU/mL的儲備溶液。
二、中國藥典下的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品選擇
在中國藥典的規(guī)定下，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時應(yīng)使用藥典規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，包括USP-RSE、EP-BRP、CSE以及中國食品藥品檢定研究院的細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品。
三、凝膠法、濁度法、顯色法的區(qū)別
凝膠法主要用于半定量分析，而顯色法和濁度法則用于定量分析。
顯色法和濁度法雖然大體相似，但在檢測原理、檢測波長、檢測試劑、檢測范圍以及檢測成本上均存在差異，因此在選擇這兩種方法之前，需要根據(jù)實際需求進(jìn)行審慎而合理的考量。
當(dāng)凝膠法、顯色法和濁度法的檢測結(jié)果出現(xiàn)疑問或爭議時，應(yīng)以凝膠法的結(jié)果作為最終的判定依據(jù)。
四、檢測時必須使用檢測專用耗材嗎？
在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時，雖然不必使用專用的檢測耗材，但必須使用不含細(xì)菌內(nèi)毒素或β-葡聚糖的器具。
玻璃器具可通過超過250℃的干熱滅菌30分鐘以上來滅活細(xì)菌內(nèi)毒素，同時需避免使用可能釋放微量金屬離子（如Fe、Al、Ga、Cr等）影響檢測結(jié)果的金屬器具。
此外，對于一次性塑料器具，除需獲得生產(chǎn)商的保證外，還應(yīng)確認(rèn)其不受細(xì)菌內(nèi)毒素污染、不吸附細(xì)菌內(nèi)毒素，且洗脫物不含影響檢測結(jié)果的物質(zhì)。
五、胃腸道外給藥細(xì)菌內(nèi)毒素的限值確定
對于藥典中未規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素限值的樣品，其限值公式如下：
內(nèi)毒素限值(EU/mL)= K值(EU/kg)/人最大給藥量(mL/kg)
其中，K值根據(jù)給藥途徑的不同而有所差異。
頻繁或連續(xù)注射時，人最大給藥量為1小時內(nèi)注射的最大劑量。
▶▶參考
對于不溶于水的樣品，如果能溶于1%乙醇或1%DMSO，在進(jìn)行檢測時不會對鱟試劑造成影響。
八、樣品保存方法？
保存樣品時需注意以下幾點：
● 確保樣品中無活菌繁殖；
● 細(xì)菌內(nèi)毒素值不會隨保存期而發(fā)生變化；
● 確保保存容器無細(xì)菌內(nèi)毒素污染，無細(xì)菌內(nèi)毒素吸附，不含影響檢測結(jié)果的洗脫物。
九、如何調(diào)節(jié)樣品的pH值？
如果樣品溶液的pH值不在6.0～8.0范圍內(nèi)，則需要進(jìn)行調(diào)節(jié)以確保檢測準(zhǔn)確性。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的最佳pH值約為7.3，但由于鱟試劑中含有緩沖成分，此該檢測在pH6.0至8.0的范圍內(nèi)均可進(jìn)行。
對于可稀釋的樣品，可通過稀釋來調(diào)整pH值；對于不可稀釋的樣品，則可在樣品溶液中加入稀NaOH或HCl溶液來調(diào)節(jié)pH值。
此外，也可利用緩沖液來稀釋樣品溶液。為確保調(diào)節(jié)效果，建議使用按需配制的NaOH或HCl溶液來調(diào)整pH值。
十、檢測用試管可重復(fù)使用嗎？
檢測用試管不可重復(fù)使用。稀釋或樣品保存用試管可在進(jìn)行250℃超過30分鐘的干熱滅菌后重復(fù)使用。
一、如何溶解細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品？
對于不同類型的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，其溶解方法有所不同。
▶▶美國藥典USP細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（USP-RSE）：加入5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水（2000EU/mL），再劇烈渦旋30分鐘。
▶▶科德角國際歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（BRP）：將5mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水添加到小瓶中。使用渦旋混合器間歇混合30分鐘以復(fù)溶，以獲得初始濃度2000EU/mL的儲備溶液。
▲歐洲藥典細(xì)菌內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品
▶▶科德角國際ACC細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE-E0005）：加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用水使細(xì)菌內(nèi)毒素初始濃度達(dá)到1000EU/mL（具體濃度參考試劑CoA），劇烈渦旋1分鐘，靜置5分鐘，重復(fù)5次以充分溶解。
▲細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）
二、中國藥典下的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品選擇
在中國藥典的規(guī)定下，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時應(yīng)使用藥典規(guī)定的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，包括USP-RSE、EP-BRP、CSE以及中國食品藥品檢定研究院的細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品。
三、凝膠法、濁度法、顯色法的區(qū)別
凝膠法主要用于半定量分析，而顯色法和濁度法則用于定量分析。
顯色法和濁度法雖然大體相似，但在檢測原理、檢測波長、檢測試劑、檢測范圍以及檢測成本上均存在差異，因此在選擇這兩種方法之前，需要根據(jù)實際需求進(jìn)行審慎而合理的考量。
當(dāng)凝膠法、顯色法和濁度法的檢測結(jié)果出現(xiàn)疑問或爭議時，應(yīng)以凝膠法的結(jié)果作為最終的判定依據(jù)。
四、檢測時必須使用檢測專用耗材嗎？
在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測時，雖然不必使用專用的檢測耗材，但必須使用不含細(xì)菌內(nèi)毒素或β-葡聚糖的器具。
玻璃器具可通過超過250℃的干熱滅菌30分鐘以上來滅活細(xì)菌內(nèi)毒素，同時需避免使用可能釋放微量金屬離子（如Fe、Al、Ga、Cr等）影響檢測結(jié)果的金屬器具。
此外，對于一次性塑料器具，除需獲得生產(chǎn)商的保證外，還應(yīng)確認(rèn)其不受細(xì)菌內(nèi)毒素污染、不吸附細(xì)菌內(nèi)毒素，且洗脫物不含影響檢測結(jié)果的物質(zhì)。
五、胃腸道外給藥細(xì)菌內(nèi)毒素的限值確定
對于藥典中未規(guī)定細(xì)菌內(nèi)毒素限值的樣品，其限值公式如下：
內(nèi)毒素限值(EU/mL)= K值(EU/kg)/人最大給藥量(mL/kg)
其中，K值根據(jù)給藥途徑的不同而有所差異。
頻繁或連續(xù)注射時，人最大給藥量為1小時內(nèi)注射的最大劑量。
▶▶參考
日本、美國、歐洲藥典規(guī)定的K值（致熱細(xì)菌內(nèi)毒素量）
六、如何計算MVD（最大有效稀釋率）？
計算公式如下：
▶▶ λ：凝膠法中表示鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，光度法中表示細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的最小濃度。
此外，科德角國際的Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)配套軟件“PEXS”帶有MVD自動計算功能，方便用戶進(jìn)行快速準(zhǔn)確的計算。
▲Pyros Kinetix® Flex細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測系統(tǒng)
對于不溶于水的樣品，如果能溶于1%乙醇或1%DMSO，在進(jìn)行檢測時不會對鱟試劑造成影響。
八、樣品保存方法？
保存樣品時需注意以下幾點：
● 確保樣品中無活菌繁殖；
● 細(xì)菌內(nèi)毒素值不會隨保存期而發(fā)生變化；
● 確保保存容器無細(xì)菌內(nèi)毒素污染，無細(xì)菌內(nèi)毒素吸附，不含影響檢測結(jié)果的洗脫物。
九、如何調(diào)節(jié)樣品的pH值？
如果樣品溶液的pH值不在6.0～8.0范圍內(nèi)，則需要進(jìn)行調(diào)節(jié)以確保檢測準(zhǔn)確性。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的最佳pH值約為7.3，但由于鱟試劑中含有緩沖成分，此該檢測在pH6.0至8.0的范圍內(nèi)均可進(jìn)行。
對于可稀釋的樣品，可通過稀釋來調(diào)整pH值；對于不可稀釋的樣品，則可在樣品溶液中加入稀NaOH或HCl溶液來調(diào)節(jié)pH值。
此外，也可利用緩沖液來稀釋樣品溶液。為確保調(diào)節(jié)效果，建議使用按需配制的NaOH或HCl溶液來調(diào)整pH值。
十、檢測用試管可重復(fù)使用嗎？
檢測用試管不可重復(fù)使用。稀釋或樣品保存用試管可在進(jìn)行250℃超過30分鐘的干熱滅菌后重復(fù)使用。
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