Countstar Rigel細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在原代細(xì)胞檢測中的應(yīng)用

一、原代細(xì)胞的簡介以及應(yīng)用 
原代細(xì)胞是指從機(jī)體內(nèi)取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞，原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊。
 
二、原代細(xì)胞的提取方法
1、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。.
 
2、實(shí)體組織材料的分離方法
（1）機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號針），使細(xì)胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
（2）消化分離法
a、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶
（a）胰蛋白酶分散技術(shù)
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。胰蛋白酶對細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機(jī)鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長短等。
（b）膠原酶（Collagenase）消化法
適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，最終濃度0.1~0.3mg/mL.
b、非酶消化法（EDTA消化法）
常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。
 
三、原代細(xì)胞的計(jì)數(shù)
對于剛提取出來的原代細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)中，精準(zhǔn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)是必不可少的，雖然臺盼藍(lán)染色是常用的活細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法，但是臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)在于區(qū)分原代細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)和碎片，對于原代細(xì)胞來說，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)出來的濃度與活率與真實(shí)值相差的比較大，對于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有影響(圖1)。
 

利用Countstar雙熒光AO/PI的方法檢測可以有效避免雜質(zhì)和碎片的影響，從而對細(xì)胞濃度和活率進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。在Countstar Rigel系統(tǒng)中，具有完整細(xì)胞膜的有核細(xì)胞染綠色熒光并被計(jì)為活細(xì)胞，而具有受損細(xì)胞膜的有核細(xì)胞染紅色熒光并被計(jì)為死細(xì)胞，對于一些無核雜質(zhì)和碎片不發(fā)光，Countstar Rigel可以把它們忽略掉。(圖2、圖3)