Micro-CT在牙科研究中的應(yīng)用案例分享

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院閆福華教授團(tuán)隊(duì)的劉佳盈、陳斌等人的研究成果"Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration"在學(xué)術(shù)期刊 STEM CELL RESEARCH & THERAPY上成功發(fā)表，海斯菲德公司的Micro CT產(chǎn)品（產(chǎn)品型號(hào)：Hiscan XM）在論文中提供了重要的大鼠牙槽骨顯微CT重建圖像。

 

目的：探究在基于牙周膜干細(xì)胞（PDLSC）的牙周再生過程中巨噬細(xì)胞是否以及如何參與PDLSC再生過程中的組織穩(wěn)態(tài)和創(chuàng)面愈合。

實(shí)驗(yàn)方法：利用大鼠牙周缺損模型觀察PDLSC移植增強(qiáng)牙周修復(fù)過程中的再生過程。分別于術(shù)后第3、7和21天觀察M1 / M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，并在第21天分析再生的結(jié)果。此外，作者為了進(jìn)一步研究PDLSCs對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，使用PDLSCs的條件培養(yǎng)基處理M0，M1和M2巨噬細(xì)胞24小時(shí)后同時(shí)在巨噬細(xì)胞中評(píng)估了M1 / M2極化標(biāo)記。

結(jié)果：在第21天，Micro-CT掃描結(jié)果顯示在PDLSC治療組中的骨體積和骨小梁的平均厚度增加。同時(shí)，經(jīng)PDLSC治療的牙周再生增強(qiáng)，同時(shí)伴有明顯的膠原纖維形成。此外作者還發(fā)現(xiàn)PDLSC培養(yǎng)可通過下調(diào)TNF-α并上調(diào)IL-10，Arg-1和CD163誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎表型極化。

結(jié)論：PDLSCs可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型表型極化，并且在組織修復(fù)的早期極化向M2巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變有助于干細(xì)胞移植后牙周再生的增強(qiáng)。因此，來自移植的PDLSC的信號(hào)可能會(huì)改變免疫微環(huán)境，從而增強(qiáng)牙周再生。

 

作者選用了5周齡雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠的第一、二磨牙進(jìn)行 PDLSC 分離、培養(yǎng)和鑒定。

實(shí)驗(yàn)選用了SD大鼠的股骨和脛骨用于分離BMDM。培養(yǎng)分離的細(xì)胞時(shí)使用補(bǔ)充了10％的FBS，1％的P/S和40 ng/ml巨噬細(xì)胞集落刺激因子的DMEM（M-CSF,PeproTech, USA）。在培養(yǎng)開始7天后，用50 ng / ml脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich）和30 ng / ml干擾素-γ（IFN-γ, PeproTech, USA）或20 ng / ml 的白細(xì)胞介素4刺激BMDM24小時(shí)。7天后用50％的PDLSC-CM替換條件組的培養(yǎng)基而對(duì)于測(cè)試組使用50%的新鮮培養(yǎng)基替換并培養(yǎng)24h。

實(shí)驗(yàn)選用了7周齡SD大鼠共42只，隨機(jī)分為以下3組：空白組，膠原膜組和PDLSCs膠原膜組。對(duì)于PDLSCs膠原膜組，在膠原膜(Bio-Gide®, Geistlich, Switzerland)上添加20ul 的PDLSCs懸浮液（10^6 cell/ml）。在大鼠的右側(cè)口腔面皮膚上作前后方向的切口，進(jìn)入下頜骨，并使用牙鉆和大量的鹽水使得第一和第二磨牙的牙根暴露形成大約5mm×1.5 mm×0.8 mm的缺損。術(shù)后3天和7天，每組隨機(jī)處死4只。術(shù)后21天，每組隨機(jī)處死6只，取下右下頜骨并用4%多聚甲醛固定以便下一步治療。

 

作者通過將帶有異體PDLSCs的膜材料移植到老鼠的牙周缺損處(圖2 A, C)并在手術(shù)后的21天通過顯微ct重建對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，使用PDLSC治療組有相對(duì)更為連續(xù)的骨再生現(xiàn)象(圖2 b)。作者還發(fā)現(xiàn)，使用PDLSC治療后的小鼠的骨體積和平均骨小梁厚度(TbTh)有顯著增加(圖2 D, E)。同時(shí)組織學(xué)切片的HE和Masson染色可以進(jìn)一步觀察到PDLSC組的新生骨幾乎完全覆蓋了牙周缺損(圖2 H)�？梢宰C明牙周再生的關(guān)鍵表現(xiàn)為膠原纖維走向良好并且在牙本質(zhì)表面有類牙骨質(zhì)物體生成。而在其他兩組中未觀察到相似結(jié)構(gòu)。因此作者認(rèn)為牙骨質(zhì)再生可能與移植的PDLSCs有關(guān)。

 

 

作者在細(xì)胞因子分泌和巨噬細(xì)胞極化方面檢查了PDLSCs是否可能通過牙周愈合影響炎癥環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示手術(shù)后3天，與其他兩組相比，PDLSC組的IL-10水平較高而TNF-α分泌水平較低（圖3 A, B)，并且在未來的第7天和第21天TNF-α的水平一直在所有實(shí)驗(yàn)組中處于最低水平（圖3C-F）。而對(duì)于IL-10分泌水平，從3-21天開始PDLSC組逐漸趨于穩(wěn)定，同時(shí)在空白和膜組中IL-10分泌水平一直在增加。因此，在愈合的后期，PDLSC組中的IL-10在第21天時(shí)低于其他組（圖3A-F）。因此就總體而言，它在體內(nèi)發(fā)揮了抗炎功能。

 

 

作者進(jìn)一步研究了PDLSC對(duì)體外巨噬細(xì)胞亞群的影響。圖4A顯示被LPS和IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞呈扁平圓形，而用IL-4處理的巨噬細(xì)胞則較長(zhǎng)。通過圖4B和C可以觀察到M(LPS+IFN-γ)表達(dá)了高水平的iNOS、TNF-α和低水平的Arg-1。相反，經(jīng)IL-4處理的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的Arg-1和低水平的iNOS、TNF-α，這與未活化的巨噬細(xì)胞相似。該結(jié)果與 LPS +IFN-γ或IL-4等不同刺激處理的巨噬細(xì)胞的特征與相關(guān)研究的報(bào)道一致。

 

 

作者為了研究PDLSC對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，使用PDLSC條件培養(yǎng)基治療未活化和極化的巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到M2或抗炎巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD163。圖5AB顯示經(jīng)過PDLSC-CM處理24小時(shí)后，未激活的巨噬細(xì)胞和M（IL-4）的CD163 +巨噬細(xì)胞比例均增加。圖5CD顯示通過PDLSC條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，CD163+巨噬細(xì)胞比例在48小時(shí)有明顯增長(zhǎng)。然而，在PDLSC-CM處理24小時(shí)或48小時(shí)后，未發(fā)現(xiàn)M上CD163表達(dá)的顯著變化（LPS +IFN-γ）。因此結(jié)果表明，PDLSC通過其旁分泌產(chǎn)物誘導(dǎo)CD163在非活化和抗炎巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，而對(duì)促炎巨噬細(xì)胞沒有顯著影響。

 

 

作者為了進(jìn)一步探索PDLSC對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，定量了TNF-α，IL-10，Arg-1和iNOS的基因轉(zhuǎn)錄。如圖6所示PDLSC-CM降低了TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄，同時(shí)增加M（-）和M（IL-4）中的IL-10，Arg-1和iNOS轉(zhuǎn)錄。PDLSC-CM增加了M（LPS +IFN-γ）中iNOS的轉(zhuǎn)錄，但沒有改變TNF-α，IL-10和Arg-1轉(zhuǎn)錄。如此表明，來自PDLSCs的旁分泌產(chǎn)物通過下調(diào)TNF-α并上調(diào)IL-10和Arg-1對(duì)未活化和消炎的巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用。

 

 

綜上所述，作者的研究表明 PDLSC 移植可能通過影響巨噬細(xì)胞向 M2 亞型的極化而促進(jìn)再生。但是PDLSCs 對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制及其對(duì)牙周微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)仍需要進(jìn)一步研究。牙周創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種分子和細(xì)胞類型相互作用，在局部環(huán)境中完成再生過程。此論文對(duì)有關(guān)該流程的信息研究有限，指出了可能參與該流程的幾個(gè)相關(guān)成分，巨噬細(xì)胞對(duì)牙周再生的直接作用以及背后的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)�；�于免疫干預(yù)結(jié)合 PDLSCs 或其產(chǎn)品的新方法在牙周再生中的療效有待研究。

 

Hiscan XM Micro-CT System是一款集離體掃描和活體掃描于一體的Micro-CT。最高分辨率可達(dá)4µm。最大掃描范圍可達(dá)到75mmx210mm(多次掃描)�？勺鲂�動(dòng)物全身掃描，如小鼠、大鼠等；也可以掃描所選擇的感興趣區(qū)域，例如小鼠和大鼠的頭部、脊椎、前肢、后肢等；還可以掃描離體樣本材料，如小鼠或大鼠的股骨、脛骨、顱骨、牙齒、四肢，生物支架材料，電子元器件，建筑材料，植物土壤，植物種子，昆蟲等各種需要掃描其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的材料。

 

 

[1] Liu, Jiaying & Chen, Bin & Bao, Jun & Zhang, Yangheng & Lei, Lang & Yan, Fuhua. (2019). Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 10. 320. 10.1186/s13287-019-1409-4.