生物保存：冷凍冷藏持續(xù)物理、生化和分子反應(yīng)對(duì)樣本質(zhì)量的影響

在生物應(yīng)用中，一個(gè)廣泛討論的話題是樣本冷凍過程和最終保存和儲(chǔ)存溫度對(duì)生物樣本穩(wěn)定性的影響。為了將生物材料保存在其最佳狀態(tài)，必須采用慢速冷凍過程，并將儲(chǔ)存溫度控制在絕對(duì)最低值。這些指南已得到普遍認(rèn)可，但這一過程背后的原理卻鮮少有人詳細(xì)闡述。本白皮書的目的是為這些操作的科學(xué)依據(jù)及其對(duì)生物材料生存能力的影響提供背景資料。

樣本儲(chǔ)存過程通常被稱為生物保存，由四個(gè)階段組成：制備、冷卻、儲(chǔ)存和解凍。這些階段通過“被稱為低溫連續(xù)介質(zhì)的細(xì)胞所經(jīng)歷的深化低溫應(yīng)激之旅”緊密相連，其中在一個(gè)階段中發(fā)生的事件會(huì)影響上下游的相鄰階段 1。生物保存的最終目的是將樣本置于生命暫停狀態(tài)，使其能夠在功能齊全的條件下恢復(fù)。這一過程對(duì)包括細(xì)胞、組織、細(xì)菌、病毒和分離的亞細(xì)胞成分（細(xì)胞器、DNA、 RNA、蛋白質(zhì)）在內(nèi)的各種樣本類型都非常有效，但也可能會(huì)產(chǎn)生一些負(fù)面影響。可分為兩類： 1) 物化-滲透壓和 2) 生化/分子^2,3。最終，如果下游分析顯示樣本質(zhì)量下降，則在解凍后可以觀察到這些作用產(chǎn)生的結(jié)果。在細(xì)胞或組織樣本中，這被視為產(chǎn)率或生存能力、功能、繁殖能力的降低以及遲發(fā)性凋亡和壞死誘導(dǎo)。在細(xì)菌、病毒、亞細(xì)胞器、 DNA、 RNA 或蛋白質(zhì)樣本中，數(shù)量、質(zhì)量、純度等的下降往往是次最優(yōu)生物保存的結(jié)果。

所有生物保存都需要將樣本的溫度從常溫（通常為 37 °C）降低到最終儲(chǔ)存溫度 1,3。在冷卻階段前，將樣本放入含有低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油、乙二醇、糖等）的介質(zhì)中，并在大約 4 °C 下保持幾分鐘（<30 分鐘），以達(dá)到平衡。樣本冷卻在大約-1 °C/min的受控速率下完成，以實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳保存 4。對(duì)于細(xì)菌、病毒和分離的亞細(xì)胞成分（細(xì)胞器、 DNA、 RNA 和蛋白質(zhì)），在受控速率下冷卻不會(huì)遇到太大的問題。在受控速率下冷卻減少體積偏移，并允許水流從細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境 4-7。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脫水和細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)（鹽、離子、低溫保護(hù)劑等）的冷凍濃縮，并降低胞內(nèi)冰形成的可能性。

細(xì)胞持續(xù)脫水，直到溫度降低到玻璃轉(zhuǎn)換溫度(Tg)以下，即樣本轉(zhuǎn)變?yōu)椴Ａ�態(tài)（純水的Tg 約為-135 °C） 8。
 

雖然細(xì)胞脫水對(duì)于降低胞內(nèi)冰形成的概率非常有利，但是當(dāng)樣本儲(chǔ)存在高于 Tg的溫度下時(shí)，脫水將在整個(gè)儲(chǔ)存期間持續(xù)進(jìn)行，造成更大的損傷。隨著樣本繼續(xù)脫水，會(huì)對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸造成結(jié)構(gòu)性損傷 1。這種損傷可能對(duì)樣本造成幾個(gè)方面的危害，包括激活延遲分子修復(fù)或降解途徑（凋亡、壞死、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、DNA 修復(fù)等），如果損傷過于嚴(yán)重，則可能會(huì)在解凍后立即導(dǎo)致樣本損耗⁹。

除了冷凍對(duì)樣本產(chǎn)生的物理影響，在分子層級(jí)上也會(huì)產(chǎn)生影響，這是由如下幾個(gè)因素造成的： 1)可用能量和代謝活動(dòng)的減少； 2)生化途徑的解偶聯(lián)； 3)應(yīng)激反應(yīng)途徑的激活^9,10。在儲(chǔ)存過程中，在降低的動(dòng)能水平下（降低 10 °C 相當(dāng)于可用熱能降低 3 %），溫度的降低會(huì)導(dǎo)致新陳代謝和生化途徑的減慢1。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，一個(gè)衡量新陳代謝總變化量平均值的簡(jiǎn)單方法是 Q10，溫度每下降 10 °C（Q10為 2），新陳代謝（耗氧量）減少大約 50%^11,12。
 

本質(zhì)上，無論溫度如何，低溫儲(chǔ)存會(huì)減慢所有細(xì)胞的生化反應(yīng)，但不會(huì)停止，除非溫度低于 Tg。由于生物化學(xué)過程和途徑與溫度有關(guān)，即使在-20 °C 和-80 °C 下，生物化學(xué)反應(yīng)仍會(huì)發(fā)生，導(dǎo)致對(duì)樣本造成持續(xù)性損傷，無論是細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)菌還是病毒。這些反應(yīng)通常是不受控制和不完整的，會(huì)導(dǎo)致有毒中間化合物的形成和積累，例如自由基、厭氧代謝副產(chǎn)物以及由于必要的回收途徑或反應(yīng)所需的溫度抑制而無法清除的廢物。這些副產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致直接損傷或解凍后分子應(yīng)激反應(yīng)的激活¹⁰。使這一等式更加復(fù)雜的是，樣本所經(jīng)歷的許多應(yīng)激源在解凍時(shí)會(huì)引發(fā)分子死亡或生化降解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即使不會(huì)立即致死。這些因素包括代謝解偶聯(lián)、自由基生成、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性的改變、細(xì)胞離子平衡失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)鈣庫中鈣的釋放、滲透通量和低溫保護(hù)劑的暴露。例如，在儲(chǔ)存過程中自由基的生成和積累會(huì)直接損傷細(xì)胞和分離樣本中的 DNA、蛋白質(zhì)和線粒體的完整性 9,13,14。除了物理影響，自由基的積累還會(huì)激活 UPR 和凋亡途徑，導(dǎo)致樣本進(jìn)一步降解 15。在許多情況下，在生物保存過程中這些亞致死應(yīng)激源的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的激活，隨后由于缺乏能量以及在解凍時(shí)應(yīng)激源的不斷“積聚”而發(fā)展為繼發(fā)性壞死。這種亞致死損傷的表現(xiàn)在解凍后可能不明顯，可能需要幾個(gè)小時(shí)到幾天的時(shí)間才能檢測(cè)到 2,3。
 

如上所述，儲(chǔ)存期間的損傷在物理和分子層級(jí)上持續(xù)發(fā)生。在物理上，樣本持續(xù)經(jīng)受由冷凍誘發(fā)的脫水和溶質(zhì)濃縮影響，造成持續(xù)和加深的損傷。在生物化學(xué)上，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，盡管速率大幅降低。在 Q10 為 2 的條件下，與 37 °C (100 %)時(shí)相比， 4 °C 時(shí)耗氧速率估計(jì)為 6 %， -20 °C 時(shí)為 1.6 %，-40 °C 時(shí)為 0.5 %， -70 °C 時(shí)為 0.05 %，-80 °C 時(shí)為 0.02 %。理論上講，這一過程將持續(xù)到 Tg 達(dá)到所有生化反應(yīng)停止為止。雖然大幅降低，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間這種生化活性仍較為顯著。例如，從能量和/或耗氧量計(jì)算的角度來看，在-80 °C 下儲(chǔ)存 40 天相當(dāng)于在 37 °C 下儲(chǔ)存 1 天（在-80 °C 下儲(chǔ)存 1 年相當(dāng)于在 37 °C 下儲(chǔ)存約 9 天）。應(yīng)注意，基于溫度的生化活性抑制并不普遍，因?yàn)楦鱾�(gè)途徑、過程和反應(yīng)的反應(yīng)各不相同 16。因此，雖然受到高度抑制，但生化過程仍在繼續(xù)，但以一種解偶聯(lián)和不受控制的方式進(jìn)行，從而導(dǎo)致樣本持續(xù)降解。隨著儲(chǔ)存溫度和間隔時(shí)間的增加，這些應(yīng)激事件會(huì)在樣本中放大。各個(gè)途徑、過程和反應(yīng)對(duì)長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存的具體反應(yīng)還不清楚，但人們普遍認(rèn)為，儲(chǔ)存溫度對(duì)在發(fā)現(xiàn)明顯損傷之前的樣本儲(chǔ)存時(shí)間有著很大的影響 17,18。例如，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在給定溫度下儲(chǔ)存時(shí)間的范圍為： 4 °C 下儲(chǔ)存不到一周； -20 °C 下不到一個(gè)月； -70 °C 和-80 °C 下不到 6-12 個(gè)月。儲(chǔ)存-196 ºC 的液氮中可有效防止所有熱驅(qū)動(dòng)的化學(xué)反應(yīng)，只有電離輻射驅(qū)動(dòng)的活動(dòng)才能在該溫度下進(jìn)行。據(jù)估計(jì)，可能需要幾千年才能注意到對(duì)冷藏保存的培養(yǎng)基的可測(cè)量影響 19,20。根據(jù)報(bào)告，細(xì)菌、病毒、 DNA、 RNA 和蛋白質(zhì)樣本可在-80 °C 下儲(chǔ)存 1-2 年（或更長(zhǎng)時(shí)間）。必須注意，這些保存時(shí)間僅供參考，單個(gè)樣本的保存時(shí)間應(yīng)通過檢查解凍后特定于預(yù)期最終用途的適當(dāng)參數(shù)確定。此外，這些儲(chǔ)存時(shí)間以最終溫度下的穩(wěn)定保存為基礎(chǔ)。在任何溫度下將任何樣本反復(fù)凍融都會(huì)導(dǎo)致樣本加速降解。
 

樣本對(duì)冷凍過程的持續(xù)物理、生化和分子反應(yīng)對(duì)其質(zhì)量有很大的影響。在細(xì)胞、細(xì)菌和病毒樣本中可以經(jīng)常觀察到產(chǎn)率、生存能力、功能和繁殖能力的降低，而 DNA、 RNA和蛋白質(zhì)樣本在數(shù)量、質(zhì)量和反應(yīng)性方面的下降是常見的。假設(shè)按照既定的方案解凍樣本，質(zhì)量下降是冷凍和儲(chǔ)存過程中應(yīng)激和降解的直接結(jié)果。由于樣本在儲(chǔ)存過程中不斷損傷，樣本儲(chǔ)存的時(shí)間越長(zhǎng)，儲(chǔ)存溫度越高，樣本降解的程度就越大。如果樣本要長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，最好保存在最低可行的溫度下�？稍谝旱�中實(shí)現(xiàn)最佳儲(chǔ)存，即-196 ºC，此時(shí)所有生化反應(yīng)均停止�？紤]到在常規(guī)冷凍過程中所發(fā)生事件的復(fù)雜性，必須要了解樣本制備、冷卻、儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存時(shí)間和加熱對(duì)樣本整體質(zhì)量的影響。要獲得在給定溫度下冷凍和儲(chǔ)存的好處，需要權(quán)衡單個(gè)樣本的最終儲(chǔ)存目標(biāo)（時(shí)間、最終用途、樣本復(fù)雜度等）。

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