熒光壽命成像應(yīng)用：癌癥熱點靶標(biāo) - 四鏈DNA結(jié)構(gòu)

1953年，科學(xué)家詹姆斯-沃森和弗朗西斯-克里克發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)，遺傳學(xué)的研究進(jìn)入到分子層次，人們可以更深層的了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞途徑（圖1A）。近年，科學(xué)家在人類癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種四重螺旋體DNA分子——G-四鏈體(G-quadruplex)。它是由富含串聯(lián)重復(fù)鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的高級結(jié)構(gòu)。G-四分體(G-quartet)是四鏈體的結(jié)構(gòu)單元，由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環(huán)狀平面，兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四鏈體（圖1B）。
 
有研究表明，G-四鏈體更多的出現(xiàn)在癌細(xì)胞等快速分裂的細(xì)胞中，與癌基因的啟動子區(qū)域和DNA鏈的端粒區(qū)域相互作用。因此，G-四鏈體結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制過程有著緊密聯(lián)系，對于細(xì)胞分裂和增殖非常關(guān)鍵^[1]。那么，通過靶向調(diào)控G-四鏈體結(jié)構(gòu)將有望成為選擇性抑制癌細(xì)胞增殖的新途徑，G-四鏈體也成為了癌癥治療藥物的重要靶標(biāo)。

圖1.A：James Dewey Waston（左）& Francis Harry Compton Crick（右）
B：G4-DNA的3D結(jié)構(gòu)
鑒于G4-DNA參與到很多生物過程當(dāng)中，開發(fā)用于檢測和可視化細(xì)胞中 G4-DNA 結(jié)構(gòu)的工具也尤為重要。倫敦帝國理工學(xué)院的研究人員開發(fā)了一種能夠在活細(xì)胞中檢測G4-DNA的熒光探針——DAOTA-M2，為人們揭開了這種結(jié)構(gòu)的神秘面紗 ^[2]。
 
這種探針具備良好的活細(xì)胞滲透性和低細(xì)胞毒性，在與G4-DNA結(jié)合時會發(fā)出熒光，可以用來觀察G4-DNA是如何與活細(xì)胞內(nèi)的其他分子相互作用的。并且當(dāng)DAOTA-M2與不同的核酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)結(jié)合時，將顯示出不同的熒光壽命信息，進(jìn)而可以非常精準(zhǔn)的區(qū)別雙螺旋DNA和G4 DNA（圖2），因為與四鏈體結(jié)合時熒光壽命更長（圖3）。

圖2. 熒光壽命置換測定的示意圖：競爭對手結(jié)合后，DAOTA-M2 從 G4-DNA 轉(zhuǎn)移到 dsDNA環(huán)境，導(dǎo)致其熒光壽命縮短


圖3 DAOTA-M2染色的活細(xì)胞U2OS細(xì)胞核DNA的FLIM分析（a）以 512 × 512 分辨率（λex=477 nm，λem=550–700 nm）記錄的熒光強(qiáng)度圖像，紅線表示用于 FLIM 分析的核分割（b） 來自 a 的 FLIM 圖，顯示在平均壽命 (τw) 9ns（紅色）和 13ns（藍(lán)色）之間（c） 平均核強(qiáng)度與平均核壽命（藍(lán)點）的二維相關(guān)性（d）單個原子核的放大 FLIM 圖 - 顏色代表壽命，由 9ns（紅色）和 13ns（藍(lán)色）之間的顏色梯度條定義

G4-DNA的生物功能是通過動態(tài)的折疊和打開實現(xiàn)。在細(xì)胞內(nèi)，G4-DNA可以自發(fā)折疊，但其打開是由專門的解旋酶來完成。并且在接下來的研究中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)哺乳類動物中的DNA 解旋酶 FancJ 和 RTEL1的表達(dá)量減少將會導(dǎo)致DAOTA-M2熒光壽命變長（圖4）^[3]。因此可以直接利用DAOTA-M2熒光壽命的變化監(jiān)測G4-DNA在活細(xì)胞中的動態(tài)變化。

圖4，減少 FancJ或RTEL1 解旋酶表達(dá)如何導(dǎo)致更長的 DAOTA-M2 壽命 (τw)的示意圖
G4-DNA被認(rèn)為是潛在癌癥治療藥物靶點，因此評估給定的 G4-DNA靶向藥物與該結(jié)構(gòu)結(jié)合的能力將非常有用。通過不同處理后DAOTA-M2的熒光壽命變化，結(jié)果顯示雙羧酸功能化的Ni（Ni-salphen）與G4-DNA有很強(qiáng)的靶向結(jié)合能力，會在短時間內(nèi)導(dǎo)致DAOTA-M2熒光壽命迅速下降。（圖5）

圖5. 加入結(jié)合劑1-7hr的DAOTA-M2 的代表性 FLIM 成像結(jié)果（顯示在 6ns（紅色）和 14ns（藍(lán)色）之間）共孵育后 使用 DMSO（對照）、Zn-salphen、Nisalphen 。比例尺：20 μm

在以上的科研工作中，不難發(fā)現(xiàn)，精準(zhǔn)的檢測方法是必不可少的，比如貫穿于整篇文獻(xiàn)中的FLIM技術(shù)。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，熒光壽命成像）：是一種基于熒光壽命的顯微成像技術(shù)，其成像結(jié)果提供像素位點的壽命信息，使得我們在熒光強(qiáng)度成像之外，能更加深入地對樣品進(jìn)行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強(qiáng)度成像的眾多優(yōu)點，如不受熒光物質(zhì)濃度、光漂白、激發(fā)光強(qiáng)度等因素的影響。會因為分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子微環(huán)境、生理狀態(tài)等條件改變而發(fā)生變化。Leica全新STELLARIS 8 FALCON熒光壽命成像系統(tǒng)，搭載新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高靈敏度專用檢測器，提供超快速、多維度熒光壽命成像解決方案。
 
將特異性探針與FLIM相結(jié)合使用，不僅可以用來監(jiān)測活細(xì)胞細(xì)胞核中G4-DNA的形成，以及判定小分子藥物與G4-DNA的相互作用，還可以應(yīng)用于G4-DNA靶向藥物的篩選。這些信息將為癌癥的診斷和治療帶來了新啟示，更有助于靶向性新療法新藥物的開發(fā)。

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