免疫熒光顯微鏡的樣品制備

樣本
IF方案存在于多種不同的樣本當(dāng)中。最簡(jiǎn)單最常用的方法是對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)（真核）細(xì)胞進(jìn)行染色。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可以接種在蓋玻片上，采用多微孔插入或者直接接種在玻璃底培養(yǎng)皿上并在所需的時(shí)間用于IF檢查。IF還可在細(xì)胞涂抹于載玻片（例如細(xì)胞離心涂片）后用于懸浮細(xì)胞的檢查。在這兩種情況下，需重點(diǎn)分析細(xì)胞內(nèi)的過程或結(jié)構(gòu)，這被稱為免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）。

另一方面，在免疫組織化學(xué)（IHC）typo3/當(dāng)中通過組織特定的環(huán)境聯(lián)系來檢查是否存在蛋白質(zhì)或分子。此處器官制備的超薄切片（通常包埋在石蠟中）用于比較研究健康器官與疾病器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。

除了制備組織切片外，還可以對(duì)整個(gè)生物體進(jìn)行IF檢查，這一過程被稱為“整體IHC”。為此可使用不同生物模型的胚胎如小鼠、雞或斑馬魚等，或植物模型如擬南芥。在整體IHC中會(huì)受到試樣尺寸和相關(guān)IF試劑透化深度的限制。單獨(dú)的孵育步驟比培養(yǎng)細(xì)胞的染色要長(zhǎng)。此外還必須提供帶有特殊光學(xué)設(shè)備的顯微鏡用于大樣本分析。

清洗步驟
在IF程序中應(yīng)特別注意清洗步驟，因?yàn)?strong>適當(dāng)?shù)那逑纯梢蕴岣逫F質(zhì)量。PBS是一種標(biāo)準(zhǔn)的清洗緩沖液，而PBS++或PBS-T等變體也很普遍。PBS++含有1 mM CaCl2和MgCl2，推測(cè)其具有防止細(xì)胞分離的膜穩(wěn)定作用。對(duì)于PBS-T，添加最終濃度為0.05%的清潔劑Tween 20，目的是增加抗體的結(jié)合特異性。請(qǐng)務(wù)必注意小心地涂抹并吸取清洗緩沖液以免細(xì)胞從培養(yǎng)容器或蓋玻片上脫落。如有足夠的時(shí)間，請(qǐng)?jiān)谖�取緩沖液時(shí)等待幾分鐘，以確保清洗緩沖液有效擴(kuò)散到樣本中。IF程序的各個(gè)清洗步驟在下面的標(biāo)準(zhǔn)方案中列出。

傳統(tǒng)IF反應(yīng)的各步驟描述如下。本文結(jié)尾附有最常用的間接IF與培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)程序。

固定
固定是IF程序的第一步。其目的是保持細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織處于其當(dāng)前狀態(tài)，并通過化學(xué)試劑長(zhǎng)期保存。在固定過程中，重要的是細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持其原有的構(gòu)象。不同的固定方法對(duì)IF有用，每種試劑對(duì)一抗表位有不同的影響。抗體結(jié)合位點(diǎn)可能被掩蓋或被固定所破壞，這會(huì)損害IF染色質(zhì)量。由于每種抗體以不同的方式與抗原結(jié)合依賴于不同的固定化合物，因此有必要嘗試幾種新抗體的固定方法。

通常，合適的固定劑規(guī)格可以在抗體的數(shù)據(jù)表上找到。理想的固定應(yīng)能夠保存細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并為良好的抗體結(jié)合暴露出抗原。實(shí)際上，您必須在兩者之間取得平衡。

固定試劑可以大致劃分成2組：化學(xué)交聯(lián)劑和有機(jī)溶劑。
化學(xué)交聯(lián)劑如通過游離氨基形成的福爾馬林交聯(lián)蛋白；細(xì)胞形態(tài)在大多數(shù)情況下保存良好。但抗原也可能發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而可能減少抗體結(jié)合。戊二醛對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)也有保存固定作用，但會(huì)導(dǎo)致顯微鏡下觀察到樣本有很強(qiáng)的自發(fā)熒光（見‘對(duì)照’章節(jié)）。

有機(jī)溶劑如甲醇或丙酮等具有脫氫作用并沉淀蛋白質(zhì)，從而將其固定在細(xì)胞環(huán)境中。但切記，在該過程中可溶性分子和許多脂質(zhì)成分都會(huì)丟失。通常將甲醇和丙酮組合使用，因?yàn)楸M管甲醇最適合保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但它對(duì)許多表位有極其不利的影響，而丙酮卻破壞性較小。除此還應(yīng)該考慮到已經(jīng)存在于細(xì)胞中的熒光蛋白（如GFP），會(huì)因被有機(jī)溶劑固定而在很大程度上被破壞。如果一抗的制造商未建議使用何種固定劑，則用4%福爾馬林在室溫下處理10分鐘即可用于各種細(xì)胞系和抗原。

透化
通過透化處理，抗體可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，否則抗體就無法通過細(xì)胞的脂膜。根據(jù)固定類型，有時(shí)需要單獨(dú)的透化處理。當(dāng)用有機(jī)溶劑固定時(shí)，細(xì)胞膜已經(jīng)具有滲透性，您可以直接進(jìn)入封閉步驟。用化學(xué)交聯(lián)劑固定的細(xì)胞需要用清潔劑進(jìn)行額外處理以實(shí)現(xiàn)透化。使用Triton X-100或NP-40等傳統(tǒng)清潔劑，但也可使用皂甙、Tween 20或洋地黃皂甙。同樣，根據(jù)應(yīng)用的物質(zhì)、濃度和培養(yǎng)時(shí)間會(huì)得到不同的結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該在開始時(shí)嘗試不同的參數(shù)。典型的步驟是在室溫下用0.1% Triton X-100在PBS中透化15-20分鐘。

如果希望通過IF來分析脂質(zhì)相關(guān)蛋白或膜蛋白，則應(yīng)謹(jǐn)慎開展透化步驟（=脂質(zhì)去除）。比較理想的選擇是皂甙，能選擇性去除質(zhì)膜上的膽固醇，使細(xì)胞內(nèi)的膜基本上完好無損。如果在抗體染色前忽略了透化處理（只能通過化學(xué)交聯(lián)劑固定），則可以專門標(biāo)記細(xì)胞外質(zhì)膜結(jié)合抗原，以便將其與胞內(nèi)抗原分開來。核酸染料如DAPI或Hoechst（見‘細(xì)胞核染色和樣本封固’章節(jié)）具有膜滲透性，因此不需要透化處理。

封閉
封閉是在細(xì)胞內(nèi)最大限度降低一抗非特異性結(jié)合的重要步驟。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以使用來自牛血清白蛋白（BSA）、奶粉或血清的蛋白質(zhì)。關(guān)鍵在于，這些封閉蛋白質(zhì)并不源于產(chǎn)生一抗的物種，否則二抗對(duì)于一抗的特異性就會(huì)損失。如果您使用的是二抗，如山羊產(chǎn)生的抗小鼠一抗，則理想的封閉試劑是正常的山羊血清。通常使用濃度為1%（奶粉，BSA）至5%（正常血清）的封閉溶液，并在清洗緩沖液中稀釋。在室溫下孵育30-60分鐘。

免疫反應(yīng)
經(jīng)固定、透化和封閉制備樣本后，會(huì)開始進(jìn)行免疫反應(yīng)。樣本現(xiàn)在與特定的一抗一起孵育，以標(biāo)記所需的靶結(jié)構(gòu)。幾種一抗可同時(shí)應(yīng)用于樣本。如上所述，在間接多色I(xiàn)F中，幾種一抗必須來源于不同的物種。首先根據(jù)制造商的要求，在選定的封閉溶液中進(jìn)行抗體稀釋。如果對(duì)染色不滿意，或者如果制造商沒有提供任何有關(guān)有效稀釋的信息，您應(yīng)該嘗試使?jié)舛缺３衷?:50到1:1000之間。根據(jù)抗體的親和力，孵育時(shí)間可能會(huì)有所不同。默認(rèn)培育時(shí)間為室溫下1-2小時(shí)；也可以在4℃下過夜。

如果選擇直接IF，則可在一抗孵育后直接進(jìn)行封片，因?yàn)橐豢挂呀?jīng)帶有熒光色素。在間接IF當(dāng)中，二抗現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)一抗進(jìn)行了熒光標(biāo)記。這里的關(guān)鍵點(diǎn)在于使用一抗進(jìn)行孵育后要進(jìn)行充分清洗，以減少二抗的非特異性結(jié)合。二抗也可以在封閉溶液或清洗緩沖液中進(jìn)行稀釋。如果制造商沒有不同的指示，可以從1:200的稀釋開始，在室溫下孵育1小時(shí)。有必要避光培養(yǎng)以防出現(xiàn)熒光色素漂白。

細(xì)胞核染色與樣本封片
免疫反應(yīng)之后通常是用DNA染料對(duì)細(xì)胞核染色。另一方面，在用顯微鏡觀察時(shí)這種處理可以更好地在細(xì)胞或組織切片內(nèi)進(jìn)行定向，同時(shí)還可以指示出細(xì)胞狀態(tài)（如有絲分裂）是否為研究所需的狀態(tài)。即便在沒有透化的情況下也能進(jìn)入到細(xì)胞核并插入DNA中的染料，如Hoechst或DAPI等，可以用于此目的。有鑒于此，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)當(dāng)十分小心，避免這些染料直接與皮膚接觸！室溫下簡(jiǎn)單的細(xì)胞染色耗時(shí)大約10分鐘，期間Hoechst或DAPI需在PBS中稀釋。

完成IF步驟后，樣本必須適當(dāng)封片以便于開展顯微鏡檢查。有鑒于此，需要使用封固介質(zhì)（如Mowiol或Prolong Gold）來將樣本固定在顯微鏡載玻片上并防止樣本脫水。另外，封固介質(zhì)增加了折射率，有利于使用油浸物鏡進(jìn)行顯微鏡檢查。一些制造商提供了帶有添加劑的封固介質(zhì)，如DABCO，這是一種防止樣本光漂白的防褪色劑。根據(jù)使用的熒光色素，一些抗褪色劑比其他的更有效。

此外，還可使用添加了DNA染料的封固介質(zhì)以便在包埋期間對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，就無需進(jìn)行單獨(dú)的細(xì)胞核染色。如果使用硬化封固介質(zhì)（通常情況下），則允許樣本過夜固化，因此可以在第二天進(jìn)行顯微鏡檢查。以這種方式生產(chǎn)的玻片幾乎可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存在室溫或4℃的黑暗環(huán)境中，但請(qǐng)記住，熒光色素的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱。

對(duì)照
免疫熒光必須進(jìn)行適當(dāng)對(duì)照，以正確顯示顯微鏡圖像。缺少或不適合的對(duì)照通常會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)論和不正確的數(shù)據(jù)。首先應(yīng)當(dāng)分析只被固定、透化和封閉的樣本以便了解細(xì)胞間室的自發(fā)熒光typo3/。有時(shí)即使沒有進(jìn)行IF染色，結(jié)構(gòu)也可能出現(xiàn)強(qiáng)熒光信號(hào)。

為了進(jìn)一步的對(duì)照和調(diào)整間接IF的顯微鏡參數(shù)，使用已采用上述方法進(jìn)行處理過的樣本，但樣本還要額外使用二抗進(jìn)行孵育。首先將揭示二抗與樣本的強(qiáng)非特異性結(jié)合。其次，設(shè)置顯微鏡參數(shù)以便在該對(duì)照的圖像采集期間不記錄任何信號(hào)。此設(shè)置用作后續(xù)采集的閾值來排除二抗的假陽性信號(hào)。在直接IF當(dāng)中，自體熒光對(duì)照用于調(diào)節(jié)閾值。接下來分析與特異性一抗一起孵育的樣本，如果是間接IF，也分析與二抗一起孵育的樣本。此時(shí)應(yīng)可檢測(cè)到熒光信號(hào)，其高于自發(fā)熒光和二抗的陰性對(duì)照。

為了確保一抗特異性標(biāo)記所需結(jié)構(gòu)，一些制造商為一抗提供遮蔽特定抗原的肽封閉，從而防止抗體與其表位結(jié)合。如此處理成本高昂，但也是確定抗體特異性的最佳方法，因此得到可靠的結(jié)果。

在多色I(xiàn)F實(shí)驗(yàn)中還必須注意所選熒光色素之間的串?dāng)_。如果是第一次進(jìn)行多色I(xiàn)F檢查，建議在單獨(dú)的制備中另外染色靶向結(jié)構(gòu)，并將這些圖像與多色圖像進(jìn)行比較。最后應(yīng)該仔細(xì)查看所獲得的數(shù)據(jù)并將其與您的期望和一抗的現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

局限性
如前所述，IF檢查有諸多優(yōu)勢(shì)，但同樣也存在著一定的劣勢(shì)。關(guān)鍵點(diǎn)是樣本的固定：固定意味著滅活，因此活細(xì)胞成像已變得不再可能。因此對(duì)動(dòng)態(tài)過程的分析會(huì)比較復(fù)雜，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞都必須予以固定和染色。所以快速動(dòng)態(tài)過程無法通過IF來進(jìn)行觀察。這顯然是融合蛋白表達(dá)熒光標(biāo)記如GFP（綠色熒光蛋白）的優(yōu)勢(shì)，比較適合用于活細(xì)胞成像。

如上所述，IF實(shí)驗(yàn)過程中（固定/透化）會(huì)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此偽影可解釋為假陽性信號(hào)。所以有必要為每個(gè)IF染色準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)膶?duì)照品，可能很費(fèi)時(shí)。另一個(gè)缺點(diǎn)同樣不可避免：熒光染料的光漂白。像GFP這樣的熒光蛋白也受此影響，但當(dāng)儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)臈l件下，即使在幾個(gè)月的永久性制備后，GFP也能被檢測(cè)到。相反，IF熒光色素的強(qiáng)度損失更快，這反映在顯微鏡下樣本的快速漂白。即使是用抗褪色劑封固介質(zhì)也只能暫時(shí)起作用。

標(biāo)準(zhǔn)IF流程
IF實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間：約5個(gè)小時(shí)。
這是一種蓋玻片上通過化學(xué)交聯(lián)劑進(jìn)行固定的培育細(xì)胞接受間接IF檢查的標(biāo)準(zhǔn)方案。

· 濕盒非常適合IF實(shí)驗(yàn)，并且可以輕松完成自制（見幻燈片“如何制備濕盒”）。該處理可防止試劑干燥并允許在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)，這對(duì)于處理熒光色素很重要，并且對(duì)于已經(jīng)存在的熒光蛋白是必要的。
· 試劑用量的選擇要確保蓋玻片能夠完全濕潤(rùn)。確保樣本絕對(duì)不會(huì)完全干燥。
· 所有培育步驟都在室溫下完成。
1. 清洗細(xì)胞兩次并使用鑷子小心地將帶有向上翻轉(zhuǎn)細(xì)胞的蓋玻片放入濕盒。
2. 使用4% 福爾馬林進(jìn)行10分鐘的固定并清洗3次。
3. 使用0.1% TX-100/PBS進(jìn)行15-20分鐘的透化處理并清洗3次。
4. 使用5%正常山羊血清/PBS或1% BSA/PBS進(jìn)行45分鐘的封閉（無需清洗）。
5. 在封閉溶液內(nèi)稀釋一抗并使用2小時(shí)（或在4℃下連夜使用）。清洗4次將未結(jié)合的一抗徹底清除掉。
6. 使用二抗進(jìn)行1個(gè)小時(shí)的孵育，在封閉溶液或清洗緩沖液內(nèi)進(jìn)行稀釋。
7. 吸取二抗，如有需要可使用Hoechst或DAPI [1 μg/ML]在PBS當(dāng)中孵育10分鐘。徹底清洗4次，即便此時(shí)還沒有出現(xiàn)細(xì)胞核染色。
8. 用鑷子輕輕取出蓋玻片并將其進(jìn)入H2O內(nèi)，清除掉清洗緩沖液的殘留鹽分。
9. 在顯微鏡載玻片上滴一滴封固溶液并將蓋玻片與細(xì)胞倒置這滴溶液上。用鑷子輕輕按壓試樣，使封固介質(zhì)均勻分布而不會(huì)擠壓樣本。
10.固化后就準(zhǔn)備好進(jìn)行顯微鏡觀察了。

配方
清洗緩沖液
· 1 × PBS（磷酸鹽生理鹽水緩沖液）
1. 137 mM：NaCI
2. 2.7 mM：KCI
3. 10mM：Na2HPO4
4. 1.8 mM：KH2PO4

· 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4
· 如為PBS++，需添加最終濃度為1 mM的CaCl2和MgCl2
· 如為PBS-T，需添加最終濃度為0.05%的Tween 20

固定緩沖液
· 福爾馬林：
1. 將4% PFA（多聚甲醛）溶解于溫暖（50-70℃）的dH2O當(dāng)中，pH值8（使用NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)）。
2. 將10 × PBS添加到最終濃度為1 × PBS的溶液當(dāng)中（如100 mL 10 × PBS溶于900 mL 4% PFA/dH2O）。
3. 使用HCI將pH值調(diào)節(jié)到7.2-7.4。

· 甲醇（預(yù)先冷凍至-20℃）：
1. 100%甲醇（-20℃）

· 甲醇/丙酮（預(yù)先冷凍至 -20℃）：
1. 50%甲醇（-20℃）和50 %丙酮（-20℃）

· TX-100（Triton X-100)：
1. PBS，最終濃度0.1% TX-100

· 皂甙：
1. PBS，最終濃度0.1%的皂甙

· 其他清潔劑可在PBS當(dāng)中以相同濃度進(jìn)行使用。

封閉緩沖液
· BSA（牛血清蛋白）：
1. PBS，最終濃度為1% BSA

· 奶粉：
1. PBS，最終濃度為1%奶粉

· 正常血清：
1. PBS，最終濃度為5%正常血清

細(xì)胞核染料
· Hoechst或DAPI：
1. 在PBS中制備Hoechst 33342或DAPI溶液，最終工作濃度為1 μg/mL。