高拉伸可誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙和肌動(dòng)蛋白絲重塑

大隱靜脈 (SVs) 在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù) (CABG) 中被廣泛應(yīng)用，用于缺血心臟的重建，因?yàn)槠溟L(zhǎng)度和易于通過手術(shù)獲得，盡管與動(dòng)脈導(dǎo)管相比，它們的通暢度較低。外科手術(shù)和術(shù)后藥物治療的改進(jìn)降低了一些早期移植失敗概率，但不良的長(zhǎng)期結(jié)果仍然是一個(gè)關(guān)鍵問題，因?yàn)?0-60% 的患者在10 年內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)靜脈移植術(shù)失敗。

SV 移植壁暴露于突然的血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷，必須進(jìn)行重塑以發(fā)揮動(dòng)脈的作用，這一過程稱為動(dòng)脈化，可穩(wěn)定機(jī)械力并涉及肌肉細(xì)胞 (SMC) 增殖和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。這種在不同血流動(dòng)力學(xué)條件下的 SV 重塑能力得到了強(qiáng)調(diào)，這是因?yàn)閯?dòng)脈化是通過在動(dòng)脈床中插入靜脈段而誘導(dǎo)的，然后當(dāng)血管回到靜脈狀態(tài)時(shí)進(jìn)行反向重塑。問題在于，重塑過程可能會(huì)超過穩(wěn)定機(jī)械力所需的能力，從而導(dǎo)致血管管腔狹窄和晚期移植的失敗。

內(nèi)皮細(xì)胞在血管穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是心血管疾病中常見的重要潛在因素。 在 SV 移植中，剪切力和牽張力大大增加，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)改變內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 功能。已有研究表明，剪應(yīng)力的突然增加誘導(dǎo)炎性EC表型，并導(dǎo)致靜脈移植失敗。剪切應(yīng)力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響已被廣泛研究，而靜脈EC中的拉伸效應(yīng)尚不清楚。

事實(shí)上，周向拉伸是靜脈移植疾病時(shí)內(nèi)膜增生的一個(gè)關(guān)鍵因素。在靜脈移植物處放置外部支架，可限制血管擴(kuò)張，減輕內(nèi)膜增生，防止血管細(xì)胞損傷，并抑制動(dòng)脈應(yīng)激引起的血管細(xì)胞黏附分子（VCAM）和ICAM1表達(dá)增強(qiáng)。值得注意的是，當(dāng)剪切應(yīng)力增加時(shí)，支架置入避免了靜脈的周向拉伸，這表明SV移植物的內(nèi)皮功能障礙更多地依賴于循環(huán)牽張力而不是剪切應(yīng)力。然而，人隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (hSVEC) 表型循環(huán)拉伸增加的潛在細(xì)胞機(jī)制仍不清楚。

基于此，來(lái)自巴西圣保羅大學(xué)醫(yī)學(xué)院心臟研究所、美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校生物醫(yī)學(xué)工程系的等多家高校專家團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，于 Scientific Reports 上發(fā)表了題為《High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells》的最新論文。

在這里，實(shí)驗(yàn)使用不同水平的拉伸強(qiáng)度對(duì)hSVECs進(jìn)行48小時(shí)的拉伸，以評(píng)估它是否以及如何引起內(nèi)皮功能障礙。將100% 融合的細(xì)胞分別暴露于低 (2.5-5%) 或高 (12.5-15%) 水平的多向拉伸以模擬靜脈或動(dòng)脈狀況。以1hz的加載頻率進(jìn)行機(jī)械加載，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)。另外，在相同的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不施加機(jī)械載荷的細(xì)胞作為對(duì)照組。數(shù)據(jù)表明，持續(xù)高牽張力 (HS) 可誘導(dǎo)活性氧 (ROS) 介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙和肌動(dòng)蛋白絲重塑。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
 

持續(xù)的高拉伸會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙

鑒于機(jī)械力對(duì) EC 結(jié)構(gòu)和功能的重要影響，將 hSVECs 暴露于低拉伸（LS，靜脈）和高拉伸（HS，動(dòng)脈）條件下，以模擬靜脈動(dòng)脈化過程中突然的血流動(dòng)力學(xué)應(yīng)力。

與靜態(tài)對(duì)照相比(圖1 A)，HS在48 h降低了NO釋放，而LS沒有引起變化（圖1 B）。內(nèi)皮細(xì)胞通過血流動(dòng)力學(xué)力量 (流量和循環(huán)應(yīng)變) 調(diào)節(jié)NO的合成和釋放來(lái)調(diào)節(jié)血管張力和血流，而HS 誘導(dǎo)NO的減少表明了內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)觀察到炎癥標(biāo)記物E-selectin（圖1 C）和VCAM 1（圖 1D）的表面表達(dá)增加，以及持續(xù)施加 HS 后單核細(xì)胞的粘附增強(qiáng)（圖1 E）進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮功能障礙的表型。

圖 1

由于持續(xù)的 HS 導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，實(shí)驗(yàn)測(cè)試了它是否也會(huì)誘導(dǎo)間充質(zhì)表型。結(jié)果顯示，HS未能誘導(dǎo)hSVECs 中EndMT。與此相反，實(shí)驗(yàn)觀察到拉伸48小時(shí)后F-肌動(dòng)蛋白染色減少。鑒于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì) EC 結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵影響，研究人員進(jìn)一步研究了 HS 對(duì) F-肌動(dòng)蛋白模式和 EC 功能障礙的影響。

HS 重塑靜脈 ECs 中的肌動(dòng)蛋白絲，但不重塑動(dòng)脈ECs

在 LS 下培養(yǎng)的 hSVECs 顯示與靜態(tài)條件相似的皮質(zhì)F-肌動(dòng)蛋白的模式和強(qiáng)度（圖2 A、B）。相比之下，24 小時(shí) HS 導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的顯著形成（圖2 A），48 小時(shí)后 F-肌動(dòng)蛋白染色明顯減少（圖2 A、C）。z-stack 切片的3D重建證實(shí)了整個(gè)細(xì)胞中F-肌動(dòng)蛋白體積的減少（圖 2 D）。這種現(xiàn)象是可逆的，細(xì)胞在靜態(tài)條件下放置24小時(shí)后，肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維將會(huì)重新出現(xiàn)（圖2 E、F）。F-肌動(dòng)蛋白減少僅在 hSVECs 中觀察到；無(wú)論拉伸條件如何，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs ）均未顯示肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)構(gòu)的變化（圖 2 G、H）。

圖 2

HS 增加氧化應(yīng)激、NAC 治療減少拉伸誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙

眾所周知，病理性機(jī)械拉伸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中過量的ROS。因此，實(shí)驗(yàn)觀察到 HS 處理48 小時(shí)后 hSVECs 中細(xì)胞內(nèi)和線粒體的 ROS 總量增加（圖3 A-C）。實(shí)驗(yàn)假設(shè) HS 誘導(dǎo)的 ROS 是與細(xì)胞骨架重塑和內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的潛在機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)人員通過用抗氧化劑 NAC 處理細(xì)胞來(lái)測(cè)試這個(gè)想法，并觀察到 HS 誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白解聚減少（圖3 D、E）。另外，在hSVECs中，拉伸誘導(dǎo)的炎癥標(biāo)志物E-Selectin 和VCAM的增加（圖1 C，d）也由NAC減弱（圖3 F、G）。這些數(shù)據(jù)與 ROS 在 HS 引起的隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中起重要作用的觀點(diǎn)一致。

圖 3

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
 

最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體外 HS 降低了 NO 生物利用度，增加了炎癥粘附分子（E-選擇素和 VCAM1）的表達(dá)和 THP-1 細(xì)胞的粘附。HS 降低 hSVECs 中的 F-肌動(dòng)蛋白，但不會(huì)降低人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的 F-肌動(dòng)蛋白，并且伴隨著 G-肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白素的核穿梭以及活性氧 (ROS) 的增加。用抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 進(jìn)行預(yù)處理支持這一觀察結(jié)果，并減少了拉伸誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重塑和炎癥粘附分子的表達(dá)。

總之，實(shí)驗(yàn)提供的證據(jù)表明氧化應(yīng)激的增加和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑在 HS 誘導(dǎo)的隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中起作用。人們很容易推測(cè)，所描述的這種內(nèi)皮功能障礙和細(xì)胞適應(yīng)模式會(huì)導(dǎo)致大隱靜脈移植失敗。

參考文獻(xiàn)：Girão-Silva T, Fonseca-Alaniz MH, Ribeiro-Silva JC, Lee J, Patil NP, Dallan LA, Baker AB, Harmsen MC, Krieger JE, Miyakawa AA. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Sci Rep. 2021 Jun 29;11(1):13493. doi: 10.1038/s41598-021-93081-3. PMID: 34188159; PMCID: PMC8242094.

 

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