通過p130Cas介導(dǎo)的NF-κB活性的減弱來機械調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)

機械力是正常細胞功能不可或缺的一部分，其破壞會導(dǎo)致體內(nèi)平衡的喪失。盡管已知骨骼對機械負荷有反應(yīng)，但人們對骨骼穩(wěn)態(tài)機械調(diào)節(jié)的分子機制知之甚少。

無處不在表達的銜接分子 p130Cas（Crk 相關(guān)底物，以下稱為 Cas）在細胞外基質(zhì)參與后在粘著斑處磷酸化，參與各種細胞過程，包括遷移、存活、轉(zhuǎn)化和侵襲。之前已經(jīng)證明 Cas 通過力依賴的構(gòu)象變化而起到獨立于離子通道的細胞骨架機械傳感器的作用。然而，目前尚不清楚 Cas 是否參與了體內(nèi)機械力的反應(yīng)。

核因子 κB (NF-κB) 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)炎癥和衰老中起著核心作用。因為 NF-κB 可以普遍表達并據(jù)報道稱具有機械響應(yīng)性，所以可以推測 Cas 可能與 NF-κB 在與炎癥和衰老相關(guān)的機體穩(wěn)態(tài)的機械調(diào)節(jié)中相互作用。

間質(zhì)液分布在所有動物的整個身體中，由大部分細胞外液組成，其體積約為循環(huán)血漿的四倍。骨骼是一個新陳代謝活躍的器官，正在進行不斷的重塑，它不是完全的固體，而是一個含有間質(zhì)液體的可變形的多孔體。

骨細胞是成熟骨骼中最常見的細胞。在板層骨中，骨細胞及其高度互連的樹突狀突起分別位于稱為腔隙和小管的空間內(nèi)。由機械負荷引起的骨骼變形會在腔隙小管系統(tǒng)中產(chǎn)生間質(zhì)液流動，從而對骨細胞產(chǎn)生剪切應(yīng)力。

基于此，由來自新加坡國立大學(xué)機械生物學(xué)研究所、日本東京都老年醫(yī)院等在內(nèi)的多所機構(gòu)進行了合作研究，于Science Advances 發(fā)表了研究論文。研究人員假設(shè)骨細胞中的 Cas-NF-κB 相互作用可能參與骨穩(wěn)態(tài)的機械調(diào)節(jié)。

實驗結(jié)果：

為了驗證關(guān)于 Cas 和 NF-κB 在骨代謝中的機械作用的假設(shè)，實驗使用了小鼠骨卸載模型，其中每只小鼠的一個后肢接受坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除術(shù)，而另一個暴露進行假手術(shù)作為對照。與對側(cè)對照相比，卸載的股骨表現(xiàn)出顯著的骨體積減少（圖1 A）。

出乎意料的是，相當(dāng)比例的 Cas 分布在對照骨的骨細胞核中，而大多數(shù) Cas 分布在卸載骨的胞質(zhì)中（圖1 B）。此外，與 NF-κB 活性相關(guān)的 RelA 乙酰化，與對側(cè)對照相比，在卸載脛骨的骨細胞中增加（圖1 C，左側(cè)和中間）。值得注意的是，RelA 在骨細胞中的核分布沒有因卸載而發(fā)生顯著改變（圖1 C，右）。

總之，機械負荷依賴性 Cas 核分布與骨細胞核中的 RelA 乙酰化呈負相關(guān)。這些體內(nèi)研究結(jié)果表明，Cas 和 NF-κB 可能參與先前報道的骨細胞的機械感覺功能，并有助于機械負荷相關(guān)的骨穩(wěn)態(tài)。

模擬研究表明，骨細胞暴露于峰值為 0.8-3 Pa 的流體剪切應(yīng)力 (FSS)，這是由于機械載荷作用于骨產(chǎn)生的小管間質(zhì)液流動引起的。雖然在靜態(tài)條件下生長的 MLO-Y4 骨細胞中 Cas 的核分布似乎很小，但在應(yīng)用脈沖 FSS（平均 1 Pa，1 Hz）10 分鐘后，Cas 顯著增加，甚至在 FSS 終止后 24 小時仍保持增加（圖1 D））。

相比之下，應(yīng)用 FSS 后 RelA 乙酰化降低，并持續(xù)降低至少24 小時（圖1 E）。此外，當(dāng) Cas 表達在 MLO-Y4 骨細胞中被逆轉(zhuǎn)錄病毒沉默時（圖1 F），F(xiàn)SS并沒有降低，而是增加了RelA乙�；�（圖1 G，比較2道和4道，圖1 H）。

這些結(jié)果表明，在體外骨細胞中，Cas通過核易位介導(dǎo)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的RelA乙�；�衰減。
 

圖 1

接下來，實驗研究確定 Cas 和 NF-κB 是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)骨細胞功能中發(fā)揮生理作用，結(jié)果表明 Cas 主要通過調(diào)節(jié)骨細胞NF-κB配體受體激活因子(RANKL)表達來控制破骨細胞骨吸收。

此外，為了檢查骨細胞特異性Cas條件敲除小鼠（Cas cKO）中表現(xiàn)出的骨質(zhì)流失是否與機械調(diào)節(jié)有關(guān)，進行了機械卸載實驗。與對側(cè)對照組相比，未卸載的對照組小鼠骨體積顯著減少(圖2 A)，骨吸收參數(shù)顯著增加（圖2 B）。盡管Cas cKO 小鼠的卸載后肢骨量顯著減少（圖2 A，中），但與對照小鼠相比，卸載對骨量的影響程度適中且不那么顯著(圖2 A， 右）。值得注意的是，沒有觀察到Cas cKO 小鼠的對照組和卸載骨組之間的骨吸收參數(shù)存在顯著差異（圖2 B）。

在對照組小鼠中，與來自對側(cè)對照組的小鼠相比，由卸載骨制備的骨細胞分數(shù)中的 RANKL mRNA 表達增加（圖2 C，第1 和第2列）。然而，無論卸載與否，Cas cKO 小鼠的骨細胞分數(shù)中的 RANKL 表達都得到了增強（圖2 C，第3 和第4 列）。

在對照組和Cas cKO 小鼠中，很可能是卸載后骨形成減少，導(dǎo)致骨體積減少（圖2 A）。盡管在對照組和Cas cKO 小鼠中觀察到骨形成參數(shù)降低的相似趨勢，但由于每個參數(shù)的變異性很大，無法在對照組和Cas cKO小鼠中檢測到顯著差異。

與體內(nèi)實驗結(jié)果一致（圖2 C），應(yīng)用 FSS 后 24 小時，MLO-Y4 骨細胞中的 RANKL 表達降低（圖2 D，1道和2道），而在敲除Cas 的骨細胞中RANKL 顯著上調(diào)與 FSS 無關(guān)（圖1 F和2 D，第3 和第4 列）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，骨細胞中的 Cas 在機械負荷誘導(dǎo)的 RANKL 介導(dǎo)的骨吸收減少中起重要作用。
 

圖 2

然后，實驗檢查了 Cas 是否參與了卸載骨的骨細胞中 RelA 乙�；�的增加。與在第一組小鼠中的觀察結(jié)果一致（圖1 B、C），與對照組Casflox/flox小鼠的對側(cè)骨細胞相比，卸載脛骨的骨細胞中 Cas 核分布減少，RelA 乙�；�增加（圖2 E、F)。然而，無論卸載與否，Cas cKO 小鼠的RelA 乙�；�均增強，而非核分布增強（圖2 E-G）。這表明 Cas 參與了骨細胞中 RelA 乙�；�的機械負荷依賴性降低，支持了Cas-NF-κB 相互作用的生理相關(guān)性。

最后，實驗還證明 Cas 負向調(diào)節(jié) RelA 乙酰化，而RelA乙�；�又通過增加骨細胞內(nèi)ROS水平來控制RANKL的表達；Cas通過干擾細胞核中的RelA-p300/CBP相互作用下調(diào)NF-κB活性；Cas-NF-κB 相互作用，通過骨細胞中的 RANKL 表達在骨吸收中發(fā)揮生理作用。

實驗結(jié)論：

在這里，實驗證明 Cas 分布在細胞核中，并通過減輕 NF-κB 活性來支持機械負荷介導(dǎo)的骨穩(wěn)態(tài)，否則會引發(fā)炎癥過程。機械卸載調(diào)節(jié)骨細胞（骨骼中的機械感覺細胞）中的 Cas 分布和 NF-κB 活性。骨細胞中的 Cas 缺乏會增加與 NF-κB 介導(dǎo)的 RANKL 表達相關(guān)的破骨吸收，導(dǎo)致骨質(zhì)減少。在對培養(yǎng)的骨細胞施加剪切應(yīng)力后，Cas 易位到細胞核中并下調(diào) NF-κB 活性。

總的來說，流體剪切應(yīng)力依賴于 Cas 介導(dǎo)的 NF-κB 活性的減輕來支持骨穩(wěn)態(tài)。鑒于 Cas 和 NF-κB 的普遍表達以及間質(zhì)液的全身分布，Cas-NF-κB 的相互作用也可能支持其他組織和器官的調(diào)控機制。

參考文獻：Miyazaki T, Zhao Z, Ichihara Y, Yoshino D, Imamura T, Sawada K, Hayano S, Kamioka H, Mori S, Hirata H, Araki K, Kawauchi K, Shigemoto K, Tanaka S, Bonewald LF, Honda H, Shinohara M, Nagao M, Ogata T, Harada I, Sawada Y. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Sci Adv. 2019 Sep 25;5(9):eaau7802. doi: 10.1126/sciadv.aau7802. PMID: 31579816; PMCID: PMC6760935.

文章來源：【Naturethink官網(wǎng)】

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