Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀在卵巢癌研究中的應(yīng)用

卵巢癌是卵巢腫瘤的一種，是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。由于卵巢癌早期缺少癥狀，即使有癥狀也不特異，篩查的作用又有限，因此早期診斷比較困難，而晚期病例又療效不佳。雖然卵巢癌的發(fā)病率低于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌居?jì)D科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過(guò)宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌之和，高居?jì)D科癌癥首位，是嚴(yán)重威脅婦女健康的疾病之一。本期小編給大家介紹幾個(gè)卵巢癌的大隊(duì)列樣本分析的經(jīng)典案例。
卵巢癌
 
案例一
利用不同蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略研究CT45—卵巢癌的化療敏感性介質(zhì)與免疫治療的新靶標(biāo)
大多數(shù)高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSOC)患者對(duì)鉑類(lèi)化療產(chǎn)生耐藥性并復(fù)發(fā)，但也有15%的患者在10年以上仍然無(wú)病。為了發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期生存的驅(qū)動(dòng)因素，由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)研究小組等研究者定量分析了微量福爾馬林固定石蠟包埋腫瘤中鉑耐藥和敏感HGSOC患者的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，運(yùn)用了基于質(zhì)譜的定量蛋白組學(xué)、磷酸化蛋白組學(xué)技術(shù)，針對(duì)卡鉑耐藥和卡鉑敏感患者進(jìn)行分析，探究高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的長(zhǎng)期生存的驅(qū)動(dòng)因素。相關(guān)研究成果發(fā)表在國(guó)際專(zhuān)業(yè)學(xué)術(shù)期刊《Cell》上。
 
研究者將25例來(lái)自美國(guó)芝加哥大學(xué)未接受化療的卵巢癌組織樣本庫(kù)的HGSOC組織樣本，用基于質(zhì)譜法的蛋白組學(xué)方法將組織樣本分離，并使用微量FFPE（石蠟包埋）樣品鑒定和定量到9000多種蛋白，定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)。在分析了9000余種蛋白水平后，發(fā)現(xiàn)CT45是高級(jí)別漿液性卵巢癌患者獨(dú)立預(yù)后因子。為了對(duì)這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證，研究者檢測(cè)了200余例卵巢癌患者腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)其中82例患者腫瘤組織中無(wú)CT45表達(dá)，42例高表達(dá)，隨訪研究發(fā)現(xiàn)CT45高表達(dá)患者無(wú)病生存期均較長(zhǎng)，壽命相比CT45缺乏的患者提高了7倍。再次證實(shí)了CT45是晚期高級(jí)別漿液性卵巢癌的獨(dú)立預(yù)后因子。

圖1 基于高分辨質(zhì)譜Orbitrap的HGSOC蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程（點(diǎn)擊查看大圖）
 
此外，研究者對(duì)化療反應(yīng)的分子機(jī)制也進(jìn)行了探討，卡鉑的標(biāo)準(zhǔn)化療能引起卵巢癌的DNA損傷，而卡鉑化療在CT45高表達(dá)腫瘤細(xì)胞中帶來(lái)的DNA損傷更為顯著，可導(dǎo)致培養(yǎng)的細(xì)胞死亡和小鼠腫瘤縮小。為了進(jìn)一步研究CT45介導(dǎo)的化療敏感性原因，研究者利用定量互作蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CT45與進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)磷酸酶4（PP4）復(fù)合物的相互作用，CT45是PP4信號(hào)傳導(dǎo)的新型內(nèi)源調(diào)節(jié)因子，通過(guò)抑制PP4參與DNA損傷途徑。而CT45過(guò)表達(dá)有效提高了腫瘤細(xì)胞的化療敏感性！未來(lái)通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞中的CT45表達(dá)有望提高鉑類(lèi)化療的療效。

 
該研究認(rèn)為CT45是卵巢癌獨(dú)立預(yù)后因子，與晚期卵巢癌患者無(wú)病生存期較長(zhǎng)顯著相關(guān)且可作為鉑類(lèi)敏感性調(diào)節(jié)劑和卵巢癌的免疫治療靶點(diǎn)。這是第一個(gè)基于質(zhì)譜法的蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)的預(yù)后和功能性的生物標(biāo)志物，運(yùn)用了包括shot-gun蛋白質(zhì)鑒定、LFQ蛋白質(zhì)定量、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)以及免疫肽組學(xué)，可見(jiàn)臨床癌癥蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定化療和免疫療法靶點(diǎn)具有非常顯著的臨床意義。
 
 
案例二
高級(jí)別漿液性卵巢癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究—
揭示卵巢癌轉(zhuǎn)移機(jī)理
2019年5月，Nature上發(fā)表了標(biāo)題為Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer-associated fibroblasts的卵巢癌研究?jī)?nèi)容（*由芝加哥大學(xué)的Ernst Lengyel團(tuán)隊(duì)發(fā)表）。該研究通過(guò)將激光捕獲顯微切割(laser-capture microdissection)與基于Orbitrap蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略結(jié)合，對(duì)臨床石蠟包埋組織樣品中細(xì)胞進(jìn)行研究，最少可做到5000個(gè)細(xì)胞。通過(guò)聯(lián)合運(yùn)用，他們發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast，CAF)中調(diào)控蛋白N-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-methyltransferase(NNMT))參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過(guò)程。
 
通過(guò)搜集了11位高級(jí)別漿液性卵巢癌（High-grade serous carcinoma，HGSC）病人107個(gè)組織樣本，然后使用顯微切割技術(shù)將腫瘤組織和基質(zhì)分別提取進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（流程見(jiàn)下圖）。
 
圖3 微量顯微切割腫瘤組織和基質(zhì)樣品蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程（點(diǎn)擊查看大圖）
 
對(duì)于這種低濃度樣本，Orbitrap高分辨質(zhì)譜可實(shí)現(xiàn)臨床石蠟樣本數(shù)據(jù)深度覆蓋，共鑒定到6944個(gè)蛋白，其中FABP4蛋白變化顯著，在網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移(omental metastases)腫瘤中高表達(dá)，比較網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移和原發(fā)型腫瘤基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)NNMT蛋白上調(diào)，NNMT介導(dǎo)催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的轉(zhuǎn)化。通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NNMT在網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的腫瘤基質(zhì)中高表達(dá)，并且當(dāng)CAF細(xì)胞中敲低NNMT后，細(xì)胞形態(tài)接近正常。
 
后續(xù)通過(guò)動(dòng)物模型驗(yàn)證蛋白表達(dá)趨勢(shì)，作者構(gòu)建HGSC轉(zhuǎn)移小鼠模型，確認(rèn)將NNMT敲低的CAF與HGSC細(xì)胞共同注射到小鼠體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤大小則顯著降低，并且用NNMT的抑制劑處理也能降低。通過(guò)臨床樣本數(shù)據(jù)分析，基質(zhì)中NNMT高表達(dá)的病人預(yù)后更差，而在腫瘤組織中NNMT高表達(dá)的病人卻并沒(méi)有顯著差異。綜上研究作者推斷NNMT是調(diào)控高級(jí)別漿液性卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵角色。
 
 
案例三
高分級(jí)漿液性卵巢癌早期診斷生物標(biāo)志物的研究新策略
加拿大Thomas Kislinger教授團(tuán)隊(duì)在Cell Systems上發(fā)表了高級(jí)別漿液性卵巢癌相關(guān)研究文章。在這篇研究中，研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)使用臨床相關(guān)患者來(lái)源的異種移植物(PDX)和N-糖肽富集的工作流程，使用原位移植的PDX模型，可以在小鼠血清背景中輕松識(shí)別“人類(lèi)獨(dú)特的”蛋白質(zhì)，從而克服與基于蛋白質(zhì)組學(xué)的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)相關(guān)的限制，目的是鑒別腫瘤相關(guān)的人來(lái)源蛋白。
  圖4 基于高分辨質(zhì)譜的異種移植物(PDX)和N-糖肽富集的工作流程（點(diǎn)擊查看大圖）
 
該研究2種不同的PDX模型，收集PDX-腫瘤和PDX-血清，以來(lái)自非移植的同基因小鼠血清（NEGsera）作陰性對(duì)照，運(yùn)用label-free定量N糖基化蛋白質(zhì)組加以分析。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組NEG血清相比，PDX-血清樣本與PDX-腫瘤樣本存在顯著差異。各樣品類(lèi)型中共鑒定到3922個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中絕大部分糖基化位點(diǎn)（約2077多個(gè)位點(diǎn)）僅在PDX-腫瘤中發(fā)現(xiàn)分布。PDX-腫瘤和PDX-血清中定量到649個(gè)位點(diǎn)，表明這些肽可用作HGSC生物標(biāo)記物�？傊�，基于PDX的N-糖蛋白組策略可以檢測(cè)血清中的腫瘤相關(guān)蛋白。
 
隨后通過(guò)生物信息學(xué)分析，作者獲得了PDX-血清中各種豐度的蛋白質(zhì)功能注釋。作者將小鼠蛋白質(zhì)定位到它們的人類(lèi)直向同源物中，產(chǎn)生總共745種獨(dú)特的蛋白質(zhì)。比較PDX-血清和PDX-腫瘤中定量到的1559個(gè)糖基化位點(diǎn)的強(qiáng)度，表明人類(lèi)獨(dú)特的糖基化位點(diǎn)在PDX-腫瘤中具有更高的強(qiáng)度。為了能夠?qū)��?lái)自HGSC患者的血清中的腫瘤相關(guān)肽進(jìn)行定量，作者使用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（PRM-MS）系統(tǒng)地開(kāi)發(fā)了靶向蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)定。他們通過(guò)優(yōu)化色譜梯度和標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（NCE）來(lái)最大化測(cè)定響應(yīng)，并通過(guò)使用穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)（SIS）肽評(píng)估測(cè)定特異性。研究者快速開(kāi)發(fā)了通過(guò)基于PDX的N-糖蛋白組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)的408種肽的PRM-MS分析，成功率為90％。

圖5 使用平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜（PRM-MS）系統(tǒng)地對(duì)潛在標(biāo)記物進(jìn)行篩選（點(diǎn)擊查看大圖）
 
該篇文章開(kāi)發(fā)的原位移植的PDX模型新策略，能夠識(shí)別潛在的新的腫瘤相關(guān)蛋白。最后，合成穩(wěn)定的同位素標(biāo)記肽的使能夠快速開(kāi)發(fā)用于HGSC患者血清定量的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析，當(dāng)然這一策略仍舊需要在更大的患者隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。
 
 
Orbitrap
大規(guī)模的臨床樣本，完善的臨床預(yù)后信息，超高深度的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，精細(xì)縝密的生物學(xué)驗(yàn)證，均需要高分辨率、高靈敏度、高質(zhì)量精度、高穩(wěn)定性的質(zhì)譜儀器作為輔助手段。歷經(jīng)多年風(fēng)雨，Orbitrap質(zhì)譜一直伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究成長(zhǎng)，終得碩果。賽默飛擁有蛋白質(zhì)組學(xué)分析的最佳工具Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀，同時(shí)具有最全面、最完整的組學(xué)分析技術(shù)流程，實(shí)現(xiàn)從蛋白質(zhì)功能到結(jié)構(gòu)的解析，并具備充分的功能驗(yàn)證手段，助力高水平研究成果產(chǎn)出。我們也更加期待蛋白質(zhì)組學(xué)驅(qū)動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成果在未來(lái)預(yù)防、診斷、治療多方面的應(yīng)用轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展。
 
參考文獻(xiàn)：
 1. Multi-level Proteomics Identifies CT45 as a Chemosensitivity Mediator and Immunotherapy Target in Ovarian Cancer https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418311668 
2. Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer-associated fibroblasts https://www.nature.com/articles/s41586-019-1173-8 
3. N-Glycoproteomics of Patient-Derived Xenografts: A Strategy to Discover Tumor-Associated Proteins in High-Grade Serous Ovarian Cancer https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30981729/
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