KLF4和AMPK在內(nèi)皮細(xì)胞脈沖剪切應(yīng)力抑制糖酵解中的作用

內(nèi)皮細(xì)胞排列在動(dòng)脈壁的管腔表面，并與血流直接接觸。動(dòng)脈直段部分的脈動(dòng)剪切應(yīng)力 (PS) 會(huì)維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)，而分岔和彎曲處的振蕩剪切應(yīng)力 (OS) 會(huì)損害內(nèi)皮功能。這種 OS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 功能障礙的特征是糖酵解、炎癥、增殖和活性氧 (ROS) 的產(chǎn)生增強(qiáng)�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些 EC 表型變化會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。

作為葡萄糖分解代謝的唯一途徑，糖酵解是內(nèi)皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源。EC 中增加的糖酵解滿(mǎn)足了 EC 遷移和增殖所需的葡萄糖消耗需求。然而，內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)度的糖酵解與腫瘤血管生成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病狀態(tài)有關(guān)。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，剪切應(yīng)力通過(guò)流動(dòng)模式調(diào)節(jié) EC 中的糖酵解。有研究表明，OS 通過(guò)穩(wěn)定 ROS 介導(dǎo)的低氧誘導(dǎo)因1α (HIF-1α) 來(lái)增加內(nèi)皮糖酵解，從而增加EC 增殖和炎癥。雖然這些報(bào)告指出 OS 下糖酵解的增加，但內(nèi)皮細(xì)胞中糖酵解對(duì)不同流動(dòng)模式的調(diào)節(jié)機(jī)制的系統(tǒng)研究仍不明確。

Krüppel 樣因子4 (KLF4) 和 AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 是參與 ECs 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的兩個(gè)主要分子。在 ECs 中，KLF4 是內(nèi)皮譜系必不可少的家族依賴(lài)型轉(zhuǎn)錄因子(TF)，也是PS 誘導(dǎo)的信號(hào)依賴(lài)型TF。在 PS 作用下，KLF4 轉(zhuǎn)錄上調(diào)許多動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)基因。

作為一種代謝指標(biāo)，AMPK 通過(guò)增加分解代謝途徑和減少合成代謝途徑來(lái)全局調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。AMPK 的激活可降低糖酵解的能量消耗，同時(shí)促進(jìn)線(xiàn)粒體氧化代謝以恢復(fù)能量穩(wěn)態(tài)。許多 AMPK 底物蛋白，例如 eNOS 和血管收縮素轉(zhuǎn)化酶2，對(duì)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

己糖激酶 (HK1) 是糖酵解途徑中的限速酶之一，HK IV，也稱(chēng)為葡萄糖激酶 (GK)，在 ECs 中大量表達(dá)。糖酵解通過(guò)葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白 (GCKR) 與 HK1 的結(jié)合受到抑制，從而將 HK1 隔離在細(xì)胞核中。糖酵解速率受GCKR水平和GCKR/HK1結(jié)合狀態(tài)的影響，這是動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的調(diào)節(jié)，并可在代謝條件下迅速改變。因此，GCKR 的表達(dá)及其翻譯后修飾是糖酵解中必不可少的調(diào)節(jié)機(jī)制。

鑒于缺乏關(guān)于剪切應(yīng)力如何通過(guò) GCKR 調(diào)節(jié) EC 糖酵解的信息，來(lái)自上海交通大學(xué)機(jī)械生物學(xué)與醫(yī)學(xué)工程研究所、美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校醫(yī)學(xué)系、香港中文大學(xué)生命與健康科學(xué)學(xué)院等機(jī)構(gòu)的專(zhuān)家學(xué)者啟動(dòng)了這項(xiàng)研究，于 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America發(fā)表了題為《Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells》的實(shí)驗(yàn)成果，以探討 KLF4 和 AMPK 通過(guò) GCKR 調(diào)控 EC 糖酵解的作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

PS在系統(tǒng)水平下調(diào)ECs 中的糖酵解

首先通過(guò)分析來(lái)自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)在 PS (12 ± 4 dyn/cm2 ) 和 OS (1 ± 4 dyn/cm2 ) 作用0至24小時(shí)的RNA-seq數(shù)據(jù)，評(píng)估了糖酵解途徑中相關(guān)基因響應(yīng)PS 與OS 的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。通路分析表明，與 OS 相比，PS從16 h開(kāi)始就普遍下調(diào)糖酵解過(guò)程中的酶（圖1 A）。這些結(jié)果證實(shí) PS 和 OS 對(duì)ECs糖酵解的調(diào)控方向相反。RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，通過(guò)qPCR證實(shí)了PS會(huì)抑制糖酵解酶（圖1 B）。

因?yàn)楸碛^遺傳調(diào)控是 ECs 響應(yīng)剪切應(yīng)力的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的組成部分，實(shí)驗(yàn)接下來(lái)研究了PS下調(diào)糖酵解基因是否與染色質(zhì)重塑有關(guān)。因此，實(shí)驗(yàn)確定了在人類(lèi)糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)兩側(cè)的轉(zhuǎn)座酶可接近性染色質(zhì)測(cè)序 (ATAC-seq) 峰（測(cè)量去濃縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)）的富集。這些糖酵解基因的啟動(dòng)子區(qū)域在OS 和PS下表現(xiàn)出ATAC峰的富集（圖1 C）。

總之，這些結(jié)果表明，糖酵解基因的 PS 抑制發(fā)生在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄水平。
 

圖 1

KLF4 響應(yīng) PS 調(diào)節(jié) GCKR 表達(dá)

除了測(cè)試 PS 下調(diào)基因外，實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了參與糖酵解的 PS 上調(diào)的基因。PS在24小時(shí)內(nèi)顯著誘導(dǎo)GCKR轉(zhuǎn)錄 (圖2 A)，并通過(guò)qPCR驗(yàn)證（圖2 B）。接下來(lái)檢查了 PS 對(duì) GCKR 啟動(dòng)子區(qū)域中 H3K27ac 富集的影響。PS富集了H3K27ac信號(hào)（圖2 C），表明在PS下GCKR啟動(dòng)子具有比OS更加去濃縮的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)探討了 PS 誘導(dǎo)的 GCKR 是否由 KLF4 表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)。根據(jù) GSE103672 數(shù)據(jù)集，在可能與 GCKR 啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子中，PS 最大程度地誘導(dǎo)了 KLF4 mRNA（圖2 D）。與在GCKR啟動(dòng)子中所預(yù)測(cè)的兩個(gè)假定的KLF4結(jié)合位點(diǎn)一致（圖2 C），RNA-seq數(shù)據(jù)表明，過(guò)表達(dá)KLF4的ECs誘導(dǎo)GCKR。（圖2 E）。

為了驗(yàn)證圖2 A-E 中的結(jié)果，在 ECs 中過(guò)表達(dá) KLF4，模仿 KLF4 的 PS 誘導(dǎo)。通過(guò)KLF4染色質(zhì)免疫沉淀( ChIP)-PCR、qPCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，KLF4過(guò)表達(dá)增加了KLF4與GCKR啟動(dòng)子的結(jié)合和GCKR的表達(dá)（圖2 F-H）。

在 ECs KLF4 敲低的相互實(shí)驗(yàn)中，PS對(duì)GCKR的誘導(dǎo)作用在mRNA和蛋白水平上減弱（圖2 I、J）。與這些結(jié)果一致，PS 增加了 KLF4 與 GCKR 啟動(dòng)子的結(jié)合并增強(qiáng)了 GCKR 的表達(dá)（圖2 B、K、L）。

小鼠胸主動(dòng)脈 (TA) 和主動(dòng)脈弓 (AA) 處于動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)與動(dòng)脈粥樣硬化流動(dòng)模式下。體內(nèi)驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從 TA 分離的內(nèi)膜中 GCKR mRNA 水平高于 AA（圖2 M）�？傊�，圖2 中的結(jié)果表明，PS 誘導(dǎo)的 GCKR 取決于 KLF4 介導(dǎo)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
 

圖 2

AMPK 磷酸化并調(diào)節(jié) GCKR

為了確定 PS 誘導(dǎo)的 GCKR 是否也涉及蛋白質(zhì)磷酸化，實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)方法來(lái)確定磷酸化位點(diǎn)和磷酸化GCKR 的相應(yīng)激酶。

總體而言，結(jié)果表明 PS 增加了 GCKR Ser-481 的 AMPK 磷酸化，這反過(guò)來(lái)增強(qiáng)了 GCKR-HK1 的相互作用，以減弱 ECs 中的 HK1 活性。

KLF4-AMPK/GCKR 抑制高水平自主跑步的小鼠的糖酵解

實(shí)驗(yàn)使用來(lái)自選擇性繁殖的小鼠模型的成年雄性小鼠，它們具有高水平的自愿輪跑能力，以證實(shí) KLF4-AMPK/GCKR在體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解的發(fā)現(xiàn)。

總體而言，數(shù)據(jù)表明，有氧運(yùn)動(dòng)可能有益于血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量利用，并且這種有益結(jié)果是由 GCKR 表達(dá)和活性增加所介導(dǎo)的。支撐機(jī)制應(yīng)該包括 KLF4 和 AMPK 分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平上的調(diào)控。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)確定了血流調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮糖酵解的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明了在體內(nèi)和體外內(nèi)皮細(xì)胞中，動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)流模式可以減少糖酵解，這是一種需要能量的代謝過(guò)程。與其他糖酵解基因的下調(diào)相反，GCKR 是糖酵解通量的抑制劑，通過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)流上調(diào)。

作為由動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)流誘導(dǎo)的先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子，KLF4 表觀遺傳重塑 GCKR 啟動(dòng)子，從而激活 GCKR。在翻譯后水平，動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)血流激活 AMPK 磷酸化 GCKR，從而增加 GCKR 與己糖激酶（糖酵解的關(guān)鍵酶）的結(jié)合。

鑒于糖酵解是利用葡萄糖支持EC代謝的重要途徑，本研究中新定義的這一機(jī)制可能與其他代謝途徑協(xié)同作用，以維持內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

參考文獻(xiàn)：Han Y, He M, Marin T, Shen H, Wang WT, Lee TY, Hong HC, Jiang ZL, Garland T Jr, Shyy JY, Gongol B, Chien S. Roles of KLF4 and AMPK in the inhibition of glycolysis by pulsatile shear stress in endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 May 25;118(21):e2103982118. doi: 10.1073/pnas.2103982118. PMID: 34001623; PMCID: PMC8166073.

文章來(lái)源：http://www.naturethink.com/?news/126.html

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