Dickkopf-1在循環(huán)拉伸期間上調(diào)UHRF1促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移

心血管系統(tǒng)不斷地暴露在由血流和壓力決定的各種機(jī)械力之下。有充分證據(jù)表明，血壓升高（高血壓）會(huì)導(dǎo)致血管重塑。血管壁介質(zhì)中的血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs) 是維持血管穩(wěn)態(tài)所必需的，在體內(nèi)受到機(jī)械循環(huán)拉伸。隨著病理性拉伸的增加，VSMCs從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚�，其特征是增殖和遷移活動(dòng)增加，收縮性喪失，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生異常。然而，機(jī)械循環(huán)拉伸調(diào)節(jié) VSMCs 功能的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

DKK1 (dickkopf-1) 是 Dickkopf 家族中研究的最深入的分泌蛋白。越來越多的研究表明，DKK1具有腫瘤促進(jìn)作用。近年來，DKK1也被確立為心血管疾病的新媒介。此外，DKK1 也可作為預(yù)測(cè)急性缺血性中風(fēng)和急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者臨床結(jié)果的潛在生物標(biāo)志物。其他一些先前的研究表明， DKK1 在調(diào)節(jié)人類血管平滑肌細(xì)胞的功能中的作用相互矛盾。因此，探索DKK1 在VSMCs 中的作用相關(guān)的分子信號(hào)通路仍然是一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)。

由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、心血管重塑與功能研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等單位的專家學(xué)者先前已經(jīng)證明，DKK1參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。靶向DKK1療法可能不僅有抗腫瘤作用，而且對(duì)心血管疾病也有保護(hù)作用，一舉兩得。因此，揭示DKK1在心血管疾病發(fā)展中的作用，對(duì)于指導(dǎo)針對(duì)DKK1的抗腫瘤藥物在心血管疾病患者腫瘤中的應(yīng)用具有重要意義。

該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證實(shí)，DKK1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)在體內(nèi)擾動(dòng)流和體外振蕩剪切應(yīng)力 (OSS) 處理下上調(diào)。DKK1 的敲低減弱了OSS 誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附和內(nèi)皮損傷。目前尚不清楚 DKK1 是否通過機(jī)械拉伸調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的功能。

因此，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入研究，于 International Journal of Biological Sciences 上聯(lián)合發(fā)表了題為《Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application》的研究成果。在這項(xiàng)研究中，以人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)和小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討了DKK1在病理牽張條件下動(dòng)脈重塑發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

機(jī)械過度拉伸增加了 VSMCs 中 DKK1 的表達(dá)

腹主動(dòng)脈縮窄 (AAC) 小鼠的收縮壓 (SBP) 和舒張壓 (DBP) 顯著高于假手術(shù)對(duì)照組小鼠。如圖1 A、C，在手術(shù)后1 周，與假手術(shù)對(duì)照組小鼠相比，AAC 小鼠的胸主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈中膜中檢測(cè)到 DKK1 蛋白水平顯著增加。取胸主動(dòng)脈并通過蛋白質(zhì)印跡分析，在AAC小鼠中DKK1的相對(duì)蛋白表達(dá)水平顯著增加（圖1 D)。通過ELISA測(cè)定小鼠血清中的DKK1水平，兩組之間未觀察到血清DKK1 水平的差異。

對(duì)人 VSMCs 進(jìn)行了進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證 DKK1 響應(yīng)高水平拉伸的變化。使用循環(huán)拉伸加載系統(tǒng)，對(duì) HASMCs 進(jìn)行不同時(shí)間長度（0、3、6、12 或 24 小時(shí)）的高強(qiáng)度拉伸（18%），HASMCs 和培養(yǎng)上清液都表現(xiàn)出 DKK1 蛋白水平隨時(shí)間依賴性增加 (圖1 E、F)，而當(dāng)細(xì)胞處于5% 循環(huán)拉伸時(shí)沒有觀察到變化。將HASMCs 在無拉伸、正常拉伸 (5%) 或高強(qiáng)度拉伸 (18%) 的情況下處理 6 小時(shí)，然后收集細(xì)胞裂解物用于蛋白質(zhì)印跡分析。DKK1 表達(dá)在高水平拉伸處理的細(xì)胞中顯著高（P < 0.05，圖1 G）。
 

圖 1

DKK1 有助于在機(jī)械拉伸下調(diào)節(jié) VSMC 功能

DKK1 在調(diào)節(jié) VSMC 功能調(diào)控中的作用目前尚不清楚。實(shí)驗(yàn)通過針對(duì)DKK1 的小干擾 RNA (siRNA) 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中來降低 VSMCs 中 DKK1 的蛋白質(zhì)表達(dá)。與用干擾siRNA轉(zhuǎn)染相比，用DKK1-siRNA 轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)有效地抑制了 DKK1 mRNA 水平（圖2 A）。

在用 DKK1-siRNA 或干擾 siRNA 轉(zhuǎn)染后，HASMCs 用 5% 或 18% 的拉伸刺激 24 小時(shí)，然后進(jìn)行 EdU 和 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移。EdU 和 CCK-8 檢測(cè)表明，18% 的循環(huán)拉伸顯著促進(jìn)了 HASMCs 的增殖，而敲低 DKK1 抑制了這種作用（P<0.05，圖2 B-D）。Transwell 測(cè)定結(jié)果表明，DKK1-siRNA 組中遷移到下腔室的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組 (圖2 E、F)。

通過WB法分析全細(xì)胞裂解物的增殖標(biāo)記物PCNA和收縮表型標(biāo)記物α-SMA的蛋白質(zhì)水平。與正常拉伸（5%）處理相比，高水平拉伸（18%）上調(diào)了PCNA 的蛋白質(zhì)水平并下調(diào)了 α-SMA 的蛋白質(zhì)水平（圖2 G-I）。通過敲低 DKK1 的表達(dá)，這些變化被部分逆轉(zhuǎn)。外源性rhDKK1的添加促進(jìn)了細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)了PCNA的表達(dá)并抑制了α-SMA的表達(dá)（圖2 J-Q）。
 

圖 2

DKK1 通過靶向 UHRF1 參與調(diào)控 HASMC 功能

考慮到 DKK1 被稱為典型 Wnt 信號(hào)通路的拮抗劑，研究人員進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以確定在循環(huán)拉伸應(yīng)用過程中，典型的Wnt通路是否參與了DKK1在HASMC 中的作用。

在差異表達(dá)的基因中，重點(diǎn)研究了一個(gè)特定的基因，UHRF1。最近的研究結(jié)果表明，UHRF1 可能在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型方面發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在高水平拉伸下UHRF1的蛋白質(zhì)水平顯著增加，而在正常條件下沒有檢測(cè)到變化。當(dāng) DKK1 在高水平拉伸下被 siRNA 敲低時(shí)，UHRF1 表達(dá)在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上顯著下調(diào)（P < 0.05，圖3 C-E)。此外，rhDKK1 的刺激顯著增加了 HASMCs 中 UHRF1 的表達(dá) (圖3 F）。

為了進(jìn)一步研究 UHRF1 是否介導(dǎo) DKK1 對(duì) HASMCs 的影響，用 siRNA 敲低 UHRF1 48 小時(shí)，并在 rhDKK1 刺激的情況下用正常 (5%) 或高水平拉伸 (18%) 處理細(xì)胞 24 小時(shí)。然后通過EdU 和 CCK-8 分析評(píng)估細(xì)胞增殖，Transwell 分析評(píng)估細(xì)胞遷移， qRT-PCR 評(píng)估 RNA 的干擾效率（P < 0.05，圖3 G）。在 rhDKK1 刺激的 HASMCs 中，敲低 UHRF1 顯著減弱了細(xì)胞增殖和遷移的增加（P<0.05，圖3 H-L）。同樣，蛋白質(zhì)印跡分析表明，敲低 UHRF1 后，PCNA 的蛋白水平顯著降低，α-SMA 的蛋白水平升高（P<0.05，圖3 M-O）。
 

圖 3

此外，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)小鼠平滑肌 (SM) 特異性 DKK1 缺失可改善血管重塑，說明DKK1 參與了由高水平拉伸引起的血管重塑和 VSMC 功能的改變；并且DKK1 是通過 YAP-TEAD 通路調(diào)節(jié)UHRF1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

在這里，實(shí)驗(yàn)證明 DKK1 是機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的 VSMC 表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵介質(zhì)。數(shù)據(jù)表明，高水平的拉伸可在體內(nèi)和體外誘導(dǎo) DKK1 的表達(dá)。在體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) SMCs 中DKK1 基因的缺失減輕了 AAC 誘導(dǎo)的血管重塑。在體外，機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的DKK1 通過YAP-TEAD 通路上調(diào) UHRF1，并導(dǎo)致 VSMC 增殖和遷移的增強(qiáng)。

總之，該研究表明，DKK1 通過 YAP-TEAD 通路調(diào)節(jié) UHRF1 表達(dá)，從而介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞功能的機(jī)械拉伸調(diào)控。

參考文獻(xiàn)：Zheng TF, Liu XL, Li X, Wang QQ, Zhao YC, Li X, Li MM, Zhang Y, Zhang M, Zhang WC, Zhang C, Zhang Y, Zhang M. Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application. Int J Biol Sci. 2021 Mar 21;17(5):1234-1249. doi: 10.7150/ijbs.56247. PMID: 33867842; PMCID: PMC8040467.

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