電鏡技術(shù)在新冠病毒形態(tài)及分子結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

2020年，對所有人來說都是不平凡的一年。新冠肺炎疫情（COVID-19）突如其來，改變了所有人的生活，截至2021年6月16日北京時間15:01，全球累計確診已達1.77億之多，累計死亡382萬多人。

一顆小小的冠狀病毒，竟讓整個世界為之改變。它長什么樣？在整個疫情的防控防治過程中，正是電鏡技術(shù)，讓病毒一覽無余。

負染色技術(shù)在第一時刻揭示了病毒的大概形貌，明確2020年這波疫情是由冠狀病毒引起；緊接著在清華大學(xué)李賽老師帶領(lǐng)下，冷凍電鏡斷層成像及子斷層圖像平均重構(gòu)技術(shù)從內(nèi)到外地揭示了真實新型冠狀病毒的全病毒三維結(jié)構(gòu)。分辨率達7.8-11Å的高清結(jié)構(gòu)，對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育、分子動力學(xué)模擬等都起到了重要作用。
 

負染色技術(shù)—鑒定病毒形態(tài)

為什么是冠狀病毒？

電鏡給了一個很重要的指標：病毒形態(tài)。

2020年1月6日，中國疾控中心通過對臨床患者分離毒株樣品進行電鏡負染色，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm，表面有皇冠一樣的突起，這就給我們一個很重要的方向指示。隨后，根據(jù)核酸序列比對以及其他鑒定方法，宣布新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)。

我國第一株新冠病毒毒種信息電鏡負染照片

負染色技術(shù)可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度。負染技術(shù)流程簡單，檢測速度快。一般幾分鐘就可以完成。

載網(wǎng)要求：

1.載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂，懸液樣品鋪不開

 載網(wǎng)輝光放電處理后，親水性增強，懸液均勻鋪開

2.碳膜載網(wǎng)：促進樣品顆粒均勻分布

徠卡高真空鍍膜儀，一機兩用：鍍膜+輝光放電

EM ACE系列鍍膜儀

負染技術(shù)—徠卡解決方案

冷凍電鏡技術(shù)—指導(dǎo)藥物和疫苗設(shè)計

清華大學(xué)生命學(xué)院李賽研究員課題組和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院傳染病診治國家重點實驗室李蘭娟院士課題組緊密合作，利用冷凍電鏡斷層成像和子斷層平均重構(gòu)技術(shù)成功解析了新冠病毒（SARS-CoV-2）全病毒三維結(jié)構(gòu)，這一重要研究成果于北京時間2020年9月15日以 “新冠病毒的全分子結(jié)構(gòu)”（Molecular architecture of the SARS-CoV-2 virus）為題在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《細胞》雜志上在線發(fā)表。

首次解析新冠全病毒分子結(jié)構(gòu)
這項研究首次解析了新冠病毒全病毒的高分辨率分子結(jié)構(gòu)，使世界對新冠病毒的認識更近一步，為抗擊疫情、治療新冠肺炎打下堅實全面的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在這項研究中，浙大團隊提供了經(jīng)嚴格滅活、含有新冠病毒的細胞培養(yǎng)液，保證了樣品的天然結(jié)構(gòu)。
清華團隊在二級實驗室提純濃縮病毒后，使用實驗室開發(fā)的高通量、高分辨冷凍電鏡斷層成像技術(shù)（cryo-ET），采集了100TB數(shù)據(jù)、篩選出2294顆病毒顆粒（目前已知的關(guān)于新冠病毒最大的cryo-ET數(shù)據(jù)集），并重構(gòu)出一顆具有代表性的完整的病毒三維結(jié)構(gòu)，分辨率達7.8-11Å。統(tǒng)計結(jié)果表明，新冠病毒囊膜平均直徑約80納米，表面約有30個刺突蛋白，內(nèi)部約有30個核糖核蛋白復(fù)合物。

新冠病毒結(jié)構(gòu)及冷凍電鏡斷層圖像

原位狀態(tài)下深度分析刺突蛋白結(jié)構(gòu)
新冠病毒的“皇冠”特征，來源于它表面的刺突蛋白，凸起于病毒表面，是其侵入人體細胞的“鑰匙”，目前大多數(shù)疫苗和抗體的研發(fā)均聚焦于該蛋白。
該研究解析出處于融合前狀態(tài)及融合后狀態(tài)的三種不同構(gòu)象刺突蛋白結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，刺突蛋白在病毒表面呈隨機分布，且可自由擺動，類似于古代武器“鏈錘”，這種靈活的特性有利于“鑰匙”及時調(diào)整方向，同細胞上更多的“鎖”（受體）結(jié)合而增加侵染細胞幾率。刺突蛋白也很脆弱，滅活和提純方式不當(dāng)可能導(dǎo)致其部分、甚至完全脫落，產(chǎn)生不正常的“禿”病毒。
刺突蛋白表面有多達66個糖基化修飾，這些糖像盾牌一樣保護病毒不被免疫識別。此前未有對病毒上天然狀態(tài)下糖基化修飾的詳細研究。在清華大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與組學(xué)平臺的幫助下，該問題得到詳細解答：相比于重組刺突蛋白，原位的糖基更大也更復(fù)雜，但總體而言相似性較大，這種相似性保證了重組刺突蛋白研發(fā)疫苗工作的有效性。

全球首次從內(nèi)到外完整揭示新冠病毒全病毒精細結(jié)構(gòu)

開創(chuàng)性揭示核糖核蛋白復(fù)合物天然結(jié)構(gòu)
新冠病毒的所有遺傳信息都編碼在其核糖核酸（RNA）上。病毒想要“繁衍”下一代，就必須保護好這根“生命之源”。冠狀病毒的RNA是所有已知RNA病毒中最長的，其直線長度可達自身直徑的100倍。如何把這根核酸“長繩”完整有序地纏繞進僅有數(shù)十納米直徑的體內(nèi)，是所有病毒都要費勁兒解決的幾何難題。這個重任主要落在核蛋白上，它像線軸一樣收納RNA，將其有序纏繞，并組裝成稱為核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）的高級結(jié)構(gòu)，才能將RNA完整塞進體內(nèi)。在病毒發(fā)生膜融合及去組裝后，它又能有條不紊的釋放RNA。這個包裝方法及過程，不僅對于新冠病毒是個未解之謎，甚至在所有正義單鏈RNA病毒中也是幾何謎題。

李賽課題組對病毒內(nèi)近30000顆RNP進行了挑選和分析，開創(chuàng)性地展示了病毒腔內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)及組裝機制。該復(fù)合物像串珠一樣將RNA組織在一起，并在病毒體內(nèi)呈現(xiàn)六聚“鳥巢”型和正四面體“金字塔”型兩種局部排列，有序地收納了RNA這根“長繩”，還增加了病毒在復(fù)雜環(huán)境中經(jīng)受物理挑戰(zhàn)的能力。這是世界范圍內(nèi)首次“看清”正義單鏈RNA病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

這一真實的病毒三維圖像讓“看不見的敵人”清晰地展現(xiàn)在世人面前，首次讓世界看到新冠病毒全病毒結(jié)構(gòu)。這一成果對疫苗及抗體研發(fā)、疫情防控宣傳、科普教育等均有重要意義。其中一位審稿人在評審意見里稱贊道：“這項工作展示了迄今為止我所見過的最完整新冠病毒形象，這也是使用冷凍電鏡斷層成像方法解析完整顆粒結(jié)構(gòu)的一次絕妙的應(yīng)用……”。法國科學(xué)院院士、著名結(jié)構(gòu)病毒學(xué)家Felix A.Rey教授來信祝賀道：“這是一個里程碑式的工作”。

 

冷凍電鏡制樣技術(shù)路線

技術(shù)流程與負染類似，但是樣品最終要經(jīng)過投入冷凍固定，在低溫電鏡下進行觀察。

徠卡EM GP2，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀，通過對樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍。包括生物樣品，工業(yè)溶劑、懸濁液、乳濁液、膠體樣品等。

冷凍電鏡技術(shù)—徠卡解決方案




近年來先后暴發(fā)的病毒疫情：如埃博拉出血熱、冠狀病毒感染引起的嚴重急性呼吸綜合征、中東呼吸綜合征和新型冠狀病毒肺炎以及寨卡病毒病等，嚴重威脅了人民生命健康和社會公共衛(wèi)生安全。因此，針對尚未表征的新發(fā)病原體，尤其是針對變異速度快、宿主范圍廣、傳播能力強的病毒病原體采取有效的防控策略尤為重要。

同時，對于新發(fā)突發(fā)病毒的感染機制的研究與抗病毒藥物的開發(fā)也是必不可少的。電鏡技術(shù)可以使病毒一覽無余，徠卡提供先進的常溫/冷凍電鏡制樣技術(shù)，將一如既往協(xié)助廣大電鏡人“看清”病毒真面目。

參考內(nèi)容：

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/最新研究成果/ 重大突破！清華大學(xué)李賽團隊與浙江大學(xué)李蘭娟團隊合作解析出新冠病毒全病毒三維結(jié)構(gòu) 

http://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/2465.htm

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