流動刺激獨立于初級纖毛的人腎近端小管芯片中的藥物轉(zhuǎn)運

腎臟芯片或腎臟微流控技術(shù)的最新進展顯示，通過概括體內(nèi)組織特征，在腎臟疾病建模和藥物誘導(dǎo)性腎損傷 (DIKI) 評估方面具有巨大的潛力。三維 (3D) 腎臟模型，從微流體裝置到生物打印近端小管，在流動下培養(yǎng)腎細胞并與細胞外基質(zhì) (ECM) 結(jié)合，推進體外建模。這種模型也引起了人們的興趣，用于臨床前藥物安全性評估，以改進藥物開發(fā)早期階段的 DIKI 預(yù)測。

盡管 DIKI 已被描述為腎單位的所有部分，但藥物主要影響近端小管上皮細胞 (PTECs)，因為該段細胞中存在的膜轉(zhuǎn)運蛋白主動分泌許多外源性物質(zhì)，這增加了細胞的暴露。大多數(shù)腎臟藥物轉(zhuǎn)運蛋白研究是在傳統(tǒng)的二維靜態(tài)細胞培養(yǎng)中進行的，盡管最近這也在 3D 腎臟模型中得到了解決。

流體剪切應(yīng)力 (FSS) 已被證明對于改善3D 腎臟模型中的體外生物活性和細胞形態(tài)很重要。PTECs 在頂端暴露于脈動流中，脈動流是由心臟的泵血作用和腎內(nèi)血流動力學(xué)控制產(chǎn)生，導(dǎo)致腎小球濾過，從而引起 FSS ，這會影響腎細胞的細胞骨架組織。此外，已證明 FSS 刺激了 PTECs 的極化，并在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)將其轉(zhuǎn)化為柱狀形態(tài)。將 PTECs 暴露于 FSS 導(dǎo)致白蛋白攝取和 P-gp 活性增加，以及通過OCT2 和 MATE1 的協(xié)同作用介導(dǎo)的有機陽離子跨細胞轉(zhuǎn)運增加。

PTECs向更接近體內(nèi)形態(tài)的這種轉(zhuǎn)變歸因于FSS, FSS被微絨毛、糖萼和存在于頂端膜的初級纖毛感知。在流動下培養(yǎng)時，初級集合管細胞和腎臟類器官中的初級纖毛數(shù)量增多。

去年，來自荷蘭拉德堡德大學(xué)藥理學(xué)和毒理學(xué)系、人類遺傳學(xué)系，德國弗萊堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科和青少年醫(yī)學(xué)中心等單位的專家對此領(lǐng)域進行了合作研究，于 Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 發(fā)表了題為《Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia》的研究成果。

這項研究旨在闡明 FSS 在人類條件永生化PTEC親本 (ciPTEC-parent) 中藥物轉(zhuǎn)運活性、白蛋白攝取和上皮細胞形態(tài)方面的作用，并將其與微流控3 D裝置 （OrganoPlate）中初級纖毛敲除的ciPTEC系進行比較，評估這是否通過初級纖毛介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。

實驗方法：

ciPTEC-parent在OrganoPlate 中培養(yǎng)，然后施加生理峰值為 2.0 dyne/cm² 或低峰值為 0.5 dyne/cm² 的 FSS。在 FSS 暴露 9 天后，測定白蛋白- FITC 攝取、p -糖蛋白 (P-gp) 和多藥耐藥相關(guān)蛋白2/4 (MRP2/4) 的活性、細胞毒性和細胞形態(tài)。
 

圖 1

實驗結(jié)果：

流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)白蛋白攝取和 P-gp 活性增加

首先，在正常或低流量培養(yǎng)的ciPTEC-parent 中評估MRP2/4和P-gp的白蛋白攝取和外排活性（圖2 A）。用白蛋白-FITCC測定cubilin- 和 megalin- 介導(dǎo)的白蛋白攝�。▓D2 A），在正常流量下與BSA(10 mg/mL)共孵育時，cubilin- 和 megalin- 介導(dǎo)的白蛋白攝取降低了0.65 ± 0.04倍 (圖2B) 。當 ciPTEC-parent在正常流量下培養(yǎng)時 ，與低流量（圖2 B）相比，白蛋白攝取增加，與BSA共孵育時，白蛋白攝取消失 (圖2B)。

P-gp活性的測定采用基于鈣黃綠素-AM的類似的方法，它可以在細胞內(nèi)自由擴散，是P-gp的底物。與 CsA（30 μM）（一種已知的 P-gp 抑制劑）共同孵育后，與正常和低流量條件相比，鈣黃綠素的積累分別增加了 3.8 ± 0.4 倍和 2.9 ± 0.7 倍（圖2 D)。同樣，與正常和低流量條件相比，暴露于 P-gp 模型抑制劑 PSC833 (5 μM) 后，觀察到鈣黃綠素的積累分別增加了 2.9 ± 0.3 倍和 2.6 ± 0.5 倍（圖 2 D)。與低流量相比，在正常流量下和與PSC833共孵育時，鈣黃綠素-AM 流出顯著增強，表明在正常流量下，在ciPTEC-parent 中P-gp活性增強（圖2 D）。然而，這種增加的外排在暴露于 CsA 時并不顯著。
 

圖 2

MRP2/4 和 P-gp 的白蛋白攝取和轉(zhuǎn)運活性在初級纖毛敲除模型中不受影響

接下來，實驗研究了正常血流中增加的白蛋白攝取和 P-gp 活性是否可以通過初級纖毛介導(dǎo)的對 FSS 的反應(yīng)來解釋。因此，在正常和低流量培養(yǎng)時，測量了cubilin- 和megalin-介導(dǎo)的白蛋白攝取以及外排轉(zhuǎn)運蛋白MRP2/4和P-gp的活性 (圖3 A)。

在正常流量下，白蛋白-FITC 攝取（0.74 ± 0.04 倍）在與 BSA 共孵育后降低（圖3 B）。與 ciPTEC-parent一致， 與低流量（圖3 B）相比，對照組在正常流量下觀察到白蛋白-FITC 攝取顯著增加，但與BSA共孵育時沒有。

MRP2 / 4活性在暴露于PSC833，MK571和Ko143后受到抑制，與正常和低流量對照，GS-MF積累分別增加3.0 ± 0.3倍和2.4 ± 0.6倍（圖3 C ）。與 ciPTEC-parent 相似，GS-MF在正常流動中比在低流動中明顯增加 (圖3 C)，但在對照組和抑制組沒有顯著差異。

在與 CsA 或 PSC833 孵育后，鈣黃綠素的積累量分別比正常流量下增加3.5 ± 0.3倍和3.4 ± 0.4倍（圖3 D）。此外，在低流量條件下，與 CsA 或 PSC833 孵育后，與對照組相比，鈣黃綠素的保留量分別增加了 2.8 ± 1.0 倍和 2.2 ± 0.7 倍（圖3 D）。 
 

圖 3

FSS 誘導(dǎo)的 PTEC 細胞形態(tài)變化

在ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中的鈣黃綠素染色的單細胞膜中測量細胞表面積、縱橫比和圓形度。在流動條件和細胞系中觀察到不同的細胞密度。在正常流動條件下，在 ciPTEC-parent 和ciPTEC-KIF3α−/−中培養(yǎng)時，細胞表面積均減少。此外，在正常流動條件下，細胞伸長與軸流方向一致，這與兩種細胞系的更高的縱橫比和ciPTEC-parent細胞的圓度降低有關(guān)。

對環(huán)孢霉素A （CsA）的細胞毒性反應(yīng)與正常流量下 P-gp 活性的增強無關(guān)

CsA是一種已知的腎毒性物質(zhì)，據(jù)報道可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和線粒體的損傷，并增加PTECs的氧化應(yīng)激。由于 P-gp 活性較低，CsA 誘導(dǎo)的細胞毒性在低流量下可能更嚴重，因此，實驗在24 h的流動條件和細胞系中研究了CsA (30 μM) 的細胞毒性反應(yīng)（圖 4）。

在 ciPTEC-parent 中（圖4 A），在正常 (94 ± 1%) 和低流量 (95 ± 1%) 條件下暴露于 CsA 后，細胞活力降低。盡管在ciPTEC-parent 中發(fā)現(xiàn)P-gp活性在低流量時降低，但這并不導(dǎo)致CsA 誘導(dǎo)的細胞毒性增加（圖4 A）。有趣的是，與 ciPTEC-parent 相比，ciPTEC-KIF3α -/-對 CsA 誘導(dǎo)的細胞毒性更敏感，無論流量如何（圖4 B)，當暴露于正常或低流量（均為71 ± 4%）時，導(dǎo)致細胞活力降低。這表明初級纖毛的相關(guān)機制，不是由流動觸發(fā)的，而是涉及更敏感的 ciPTEC-KIF3α -/- 表型。
 

圖 4
 

實驗結(jié)論：

該研究首次證明 FSS 誘導(dǎo)的 PTEC 白蛋白攝取增加、藥物外排和表型延長與初級纖毛無關(guān)。實驗在 OrganoPlate觀察到，在生理相關(guān)的脈動 FSS 下培養(yǎng)永生化 PTECs 時，白蛋白攝取、P-gp 活性和表型形態(tài)變化顯著增加。通過消耗 KIF3α 基因建立了一個沒有初級纖毛的細胞系，該基因的體內(nèi)突變體與囊腫的形成有關(guān)，囊腫是一種嚴重的腎臟疾病。

總之，該研究的意義在于證明了FSS 誘導(dǎo)的PTECs生物學(xué)特性和活性的改善不是通過初級纖毛相關(guān)機制介導(dǎo)的。

參考文獻：Vriend J, Peters JGP, Nieskens TTG, Škovroňová R, Blaimschein N, Schmidts M, Roepman R, Schirris TJJ, Russel FGM, Masereeuw R, Wilmer MJ. Flow stimulates drug transport in a human kidney proximal tubule-on-a-chip independent of primary cilia. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2020 Jan;1864(1):129433. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.129433. Epub 2019 Sep 11. PMID: 31520681.

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