自噬在牙齒移動(dòng)過(guò)程中的作用

正畸牙移動(dòng)(OTM)是在牙周韌帶(PDL)和牙槽骨特異性位點(diǎn)重塑的壓力作用下發(fā)生的。一般來(lái)說(shuō)，正畸治療對(duì)支持組織有積極的影響。然而，它可能導(dǎo)致有害的牙周反應(yīng)，包括牙槽骨和軟組織結(jié)構(gòu)的喪失，這可能對(duì)口腔康復(fù)構(gòu)成相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。

壓力在直接和間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報(bào)道，壓力可以直接參與破骨細(xì)胞的生成。壓力還可以通過(guò)一些其他細(xì)胞（如 PDL 細(xì)胞）釋放的分子運(yùn)輸作用于破骨細(xì)胞。PDL 細(xì)胞在 OTM 中受到壓力，釋放各種活性細(xì)胞因子，包括骨保護(hù)素 (OPG) 和核因子-κB 配體受體激活劑 (RANKL)，來(lái)影響破骨細(xì)胞以調(diào)節(jié) OTM 過(guò)程。

自噬是一種進(jìn)化上保守的物理分子過(guò)程，可降解細(xì)胞中不需要的或功能失調(diào)的細(xì)胞器。因此，自噬被認(rèn)為是一種保護(hù)細(xì)胞存活和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。自噬通常以低水平發(fā)生在細(xì)胞中，以維持細(xì)胞器內(nèi)環(huán)境的平衡，但在某些壓力條件下會(huì)上調(diào)。自噬在多種細(xì)胞中增加，例如人乳腺癌細(xì)胞系、軟骨細(xì)胞、椎間盤(pán)源性髓核細(xì)胞，以響應(yīng)壓力作用。

早期的電子顯微鏡研究顯示，在 OTM 期間，位于正畸牙壓力側(cè)的 PDL 細(xì)胞中的自噬增加。此外，之前的研究還發(fā)現(xiàn)，自噬通過(guò) RANKL 和 OPG 信號(hào)通路對(duì)骨質(zhì)礦化和骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。然而，自噬對(duì) OTM 期間組織響應(yīng)壓力反應(yīng)的貢獻(xiàn)仍不清楚。

基于此，由上海同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科、上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心的專家學(xué)者進(jìn)行了合作研究，試圖探討PDL細(xì)胞是否通過(guò)壓力誘導(dǎo)的自噬來(lái)調(diào)節(jié)OTM過(guò)程中破骨細(xì)胞的生成。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Journal of Periodontology 題為《Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement》。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

正畸力誘導(dǎo)PDL中的自噬

為了研究正畸力是否誘導(dǎo)自噬，建立了一個(gè)OTM模型（圖1 A）。正畸力側(cè)自噬關(guān)鍵蛋白LC3II/I和Beclin-1的表達(dá)水平高于對(duì)照組（圖1 B）。此外，實(shí)驗(yàn)組中自噬標(biāo)志物Atg5、Atg12、Atg8/LC3 mRNA表達(dá)水平也高于對(duì)照組（圖1 C）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)，施加正畸力后PDL細(xì)胞 LC3B和Beclin-1水平顯著升高（圖1 D、E）。

圖 1  在正畸力作用下，PDL 組織中的自噬增加

壓力調(diào)節(jié)PDL細(xì)胞中的自噬表達(dá)

為了確認(rèn)PDL細(xì)胞是否激活了自噬，對(duì)PDL細(xì)胞施加壓力。首先，對(duì) PDL 細(xì)胞施加 1.5 g/cm²的壓力作用 3、6、9、12 和 24 h 后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表達(dá)水平在 3、6 和 9h時(shí)升高（圖2 B）。自噬標(biāo)志物Atg5、Atg12和Atg8/LC3的mRNA表達(dá)水平也遵循類似的模式（圖2 C）。

然后，對(duì) PDL 細(xì)胞施加 1.5、3.0 和 4.5 g/cm²的壓力作用 6 h后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表達(dá)水平在 1.5 g/cm²壓力下顯著升高（圖2 D)。自噬標(biāo)志物Atg5和Atg8/LC3的mRNA表達(dá)水平也遵循類似的模式（圖2 E）。

為了確定細(xì)胞自噬通量，取PDL細(xì)胞前用50µM氯喹處理4小時(shí)。壓力誘導(dǎo)的p62蛋白的表達(dá)減少，LC3II / I蛋白的表達(dá)增加，而用氯喹處理則誘導(dǎo)p62和LC3II/I蛋白的積累（圖2 F）。

接下來(lái)，用 mRFP-GFP-LC3 腺病毒處理 PDL 細(xì)胞。在 1.5 g/cm²壓力后，每個(gè)細(xì)胞的 mRFP 陽(yáng)性自噬體和雙陽(yáng)性自噬體的數(shù)量均顯著增加（圖2 G）。

在這項(xiàng)研究中，TEM 還用于確認(rèn)壓力對(duì)自噬體和自噬溶酶體形成的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1.5 g/cm²的壓力作用6小時(shí)后，PDL細(xì)胞胞質(zhì)中自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量更高（圖2 H）。

這些結(jié)果表明，PDL細(xì)胞在壓力和響應(yīng)輕壓力作用下出現(xiàn)早期自噬。

圖 2   PDL 細(xì)胞中壓力誘導(dǎo)的自噬

自噬抑制 OTM，增加骨密度

為了探索自噬在 OTM 過(guò)程中的作用，向動(dòng)物注射自噬抑制劑 3-MA 或自噬啟動(dòng)子雷帕霉素。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，在OTM模型中，3-MA可下調(diào)牙周組織的自噬，雷帕霉素可上調(diào)自噬。在 OTM 動(dòng)物中觀察到牙齒移動(dòng)距離增加。3-MA+ OTM 組的距離顯著大于 OTM 組。這表明自噬可以抑制OTM，并增加骨密度。

正畸力后自噬抑制破骨細(xì)胞生成

接下來(lái)進(jìn)一步研究自噬如何影響破骨細(xì)胞生成，這兩者都直接參與牙齒移動(dòng)過(guò)程中的骨重塑。向 OTM 動(dòng)物注射 3-MA 和雷帕霉素，并觀察到在 3-MA 處理的 OTM 動(dòng)物中 PDL 壓力側(cè)結(jié)構(gòu)完整性喪失。然而，雷帕霉素的施用保護(hù)了 PDL 組織免受結(jié)構(gòu)完整性的損失（圖3 A）。

與對(duì)照側(cè)相比，在OTM側(cè)，TRAP染色表明注射雷帕霉素顯著減少了破骨細(xì)胞的數(shù)量（圖3 B)。RT-PCR 顯示，在 OTM 期間，用 3-MA 處理的細(xì)胞中破骨細(xì)胞相關(guān)因子 CTSK、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、TRAP 和 RANKL/OPG 的 mRNA 表達(dá)水平顯著升高。與此相反，雷帕霉素下調(diào)了破骨細(xì)胞的活性（圖3 C）。

這些結(jié)果共同證明，自噬抑制了 OTM 中的破骨細(xì)胞的生成。

圖 3   自噬抑制 PDL 組織中破骨細(xì)胞的表達(dá)

壓力誘導(dǎo)的自噬抑制 RANKL/OPG 系統(tǒng)

為了進(jìn)一步研究 PDL 細(xì)胞中自噬如何抑制破骨細(xì)胞活性的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 RANKL/OPG 的表達(dá)水平。首先，研究了在壓力作用下RANKL / OPG的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其比例顯著增加，在6h時(shí)達(dá)到最高水平，然后下降（圖4 A、B）。

為了研究自噬對(duì) RANKL/OPG 表達(dá)的影響，將 3-MA 和雷帕霉素注入 PDL 細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示 3-MA 下調(diào) PDL 細(xì)胞的自噬，雷帕霉素上調(diào)自噬（圖4 C）。

然后，使用 ELISA 來(lái)測(cè)試培養(yǎng)的PDL細(xì)胞經(jīng)6小時(shí)力加載后上清液中RANKL和OPG的蛋白水平。結(jié)果表明，在壓力作用6小時(shí)后，RANKL/OPG比值增加，而且在壓力下PDL細(xì)胞中3-MA進(jìn)一步增加了該比值 (圖4 D)。

通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在1.5 g/cm²壓力作用6h下，PDL細(xì)胞中3-MA顯著上調(diào)，雷帕霉素顯著下調(diào)RANKL/OPG比值 (圖4 E)，這表明自噬可能通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié) RANKL 和 OPG 表達(dá)之間的平衡，來(lái)負(fù)調(diào)控破骨細(xì)胞生成。

圖 4   自噬對(duì) PDL 細(xì)胞中 RANKL 和 OPG 表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

PDL 細(xì)胞中的自噬在壓力作用下被激活，并通過(guò)抑制 RANKL/OPG 系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性。這項(xiàng)研究提供了第一個(gè)科學(xué)證據(jù)，表明自噬在牙齒移動(dòng)過(guò)程中起作用。

這些發(fā)現(xiàn)增加了我們對(duì)牙齒移動(dòng)過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)力學(xué)變化背后的生物機(jī)制的理解。此外，從研究中獲得的知識(shí)可能有助于未來(lái)設(shè)計(jì)新的治療方法。

參考文獻(xiàn)：Chen L, Mo S, Hua Y. Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement. J Periodontol. 2019 Oct;90(10):1170-1181. doi: 10.1002/JPER.19-0049. Epub 2019 Jun 2. PMID: 31077358.

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