壓力誘導(dǎo)的 GDF15 有助于人牙周膜細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化

由機(jī)械力觸發(fā)的正畸牙齒移動 (OTM) 取決于牙根周圍組織的重塑。長期以來，人們一直希望加速 OTM 過程，因為它有多種潛在的好處，包括縮短治療時間和減少副作用。牙周膜細(xì)胞 (PDLCs) 是牙周組織中主要的細(xì)胞成分之一，負(fù)責(zé) OTM 期間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。到目前為止，PDLCs 中機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的遺傳變化和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍未完全了解。

巨噬細(xì)胞起源于髓系前體，在 M-CSF 和 RANKL 的刺激下可分化為破骨細(xì)胞，從而在破骨細(xì)胞活性形成和骨吸收過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞可以極化為 M1 和 M2 表型。最近的研究報道了 OTM 期間巨噬細(xì)胞M1/M2極化率升高，表明巨噬細(xì)胞極化對骨重塑的重要作用。然而，促使力誘導(dǎo) M1 樣極化的因素尚未闡明，這促使我們探索更多力誘導(dǎo)的遺傳變化，這會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和 PDLCs 在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的功能改變。

生長分化因子15 (GDF15) 是人類轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β) 超家族的成員之一。與其他家族成員一樣，它參與許多信號通路的調(diào)控，包括 ERK 和 SMADs 。至于 GDF15 在破骨細(xì)胞分化中的作用，已證明缺氧能夠誘導(dǎo) GDF15 表達(dá)，促進(jìn) NF-κB 活化，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。在腫瘤進(jìn)展中也報道了其對破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。

盡管 GDF15 在破骨細(xì)胞生成中起關(guān)鍵作用，但很少有研究報道它對機(jī)械刺激，特別是壓力刺激和隨后的生物學(xué)事件的反應(yīng)。基于此，由北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院、口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室、口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實驗室的專家學(xué)者進(jìn)行了合作研究，旨在探索 GDF15 在人PDLCs中對壓力的響應(yīng)及其對破骨細(xì)胞分化和巨噬細(xì)胞M1/M2極化的影響，并進(jìn)一步剖析了 GDF15 促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的可能分子機(jī)制，以及施加力后導(dǎo)致GDF15上調(diào)的上游調(diào)控因子。

實驗結(jié)果：

壓力誘導(dǎo)人 PDLCs 中 GDF15 的激活

為了剖析 GDF15 在 PDLCs 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，首先評估了 GDF15 對壓力的響應(yīng)。為此，將 PDLCs置于0 ~ 1.5 g/cm2的連續(xù)壓力下持續(xù)24 h，然后進(jìn)行western blot和RT-qPCR檢測GDF15的表達(dá)變化。

結(jié)果表明，在壓力刺激下，GDF15 在蛋白質(zhì)和 mRNA 水平上均顯著增加（圖1 A、B）。為了進(jìn)一步鞏固這一點，將 PDLCs 在1.5 g/cm2的壓力下持續(xù)0 - 24小時。RT-qPCR 的結(jié)果也一致證明了 GDF15 表達(dá)的上調(diào)（圖1 C ）。

因此，這些數(shù)據(jù)表明 GDF15 在人 PDLCs 中被壓力轉(zhuǎn)錄上調(diào)。

圖  1
 

GDF15促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞破骨細(xì)胞的分化

接下來，實驗試圖研究GDF15在力刺激下的功能作用，假設(shè) PDLCs 分泌的 GDF15 可能有助于單核細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化。為了測試這一點，在存在或不存在重組 GDF15 蛋白 (rGDF15) 的情況下，在 RANKL 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞中進(jìn)行了 TRAP 染色。數(shù)據(jù)表明，GDF15正調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。

為了探索 GDF15 是否在力誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用，收集GDF15敲低或?qū)φ占?xì)胞壓力處理后的PDLCs上清液，然后將 RAW264.7 細(xì)胞與這些上清液共培養(yǎng)。RT-qPCR 的結(jié)果顯示，CK 和 TRAP 的表達(dá)在 GDF15 敲低的細(xì)胞中均顯著下調(diào)，表明 GDF15 在由壓力觸發(fā)的破骨細(xì)胞分化中起重要作用。

GDF15 對于力誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和 RANKL/OPG 比率的上調(diào)起重要作用

在確定了 GDF15 對破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用后，研究人員開始解開其潛在的分子機(jī)制。PDLCs 在壓力下會產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子有助于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的募集和破骨細(xì)胞的成熟。為了檢查 GDF15 在此過程中的作用，使用 rGDF15 處理 PDLCs。隨后的 RT-qPCR 分析表明，IL-6、IL-8 和 COX2 的表達(dá)在添加 GDF15 的 PDLCs 中增強(qiáng)。相反，當(dāng) GDF15 的表達(dá)被 siRNA 敲低時，這些炎癥因子的力誘導(dǎo)上調(diào)明顯受損。

在炎癥因子中，RANKL 表達(dá)可以觸發(fā)下游信號通路，而 OPG 是破骨細(xì)胞生成的負(fù)調(diào)控因子。RANKL/OPG 在 OTM 期間被上調(diào)并發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用 rGDF15 處理 PDLCs，發(fā)現(xiàn)RANKL/OPG比值上調(diào)。相比之下，當(dāng) GDF15 表達(dá)被 siRNA 轉(zhuǎn)染敲低時，壓力誘導(dǎo)的 RANKL/OPG 上調(diào)明顯減弱。

總的來說，這些數(shù)據(jù)表明GDF15在壓力誘導(dǎo)的炎癥因子充分激活和RANKL/OPG中具有不可或缺的作用。

GDF15 促進(jìn) M1 樣巨噬細(xì)胞極化

最近的研究報道稱，壓力可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向 M1 方向極化，這在 OTM 的破骨細(xì)胞分化中起重要作用。因此，實驗研究了GDF15 是否參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。

為了闡明這一點，用 rGDF15 處理 RAW264.7 細(xì)胞。RT-qPCR結(jié)果顯示，加入GDF15后M1標(biāo)記基因IL-1β和IL-6表達(dá)增強(qiáng)，而M2標(biāo)記基因Dectin表達(dá)降低，表明GDF15促進(jìn)了RAW264.7中M1樣巨噬細(xì)胞的極化。

GDF15 有助于在壓力下激活 NF-κB 和 ERK 通路

接下來，開始探索 GDF15 促進(jìn)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的潛在機(jī)制。首先關(guān)注 NF-κB，它在細(xì)胞對機(jī)械刺激和破骨細(xì)胞分化的反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。GDF15 可能有助于 PDLCs 中 NF-κB 的激活，從而促進(jìn)下游促炎基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗證這一點，在施加壓力之前，在 PDLCs 中敲低GDF15，Western blot檢測NF-κB在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布變化。

圖2 A的結(jié)果顯示，壓力誘導(dǎo)NF-κB進(jìn)入核。然而，當(dāng) GDF15 表達(dá)被抑制時，力誘導(dǎo)的 NF-κB 進(jìn)入核的能力減弱，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中 NF-κB 增加，細(xì)胞核中NF-κB 減少。

巨噬細(xì)胞中的 NF-κB 活化對于破骨細(xì)胞分化很重要，因此檢測了 GDF15 對 RAW264.7 細(xì)胞中 NF-κB 的影響。正如預(yù)期的那樣，細(xì)胞核中 NF-κB 在 GDF15 處理的細(xì)胞中更豐富，而細(xì)胞質(zhì)中 NF-κB 則相反（圖2 B）。

這些結(jié)果表明 GDF15 有助于力誘導(dǎo)的 NF-κB 激活。

除了 NF-κB，MAPK/ERK 是破骨細(xì)胞分化的另一個重要途徑。實驗假設(shè) GDF15 也有助于力誘導(dǎo)的 ERK 激活。為了證明這一點，將 RAW264.7 細(xì)胞與用GDF15處理和壓力處理后的PDLCs上清液共培養(yǎng)。Western blot分析顯示，GDF15耗盡后，力誘導(dǎo)的ERK磷酸化水平降低 (圖2 C)。此外，GDF15 的施用還增強(qiáng)了ERK兩個經(jīng)典下游靶基因C-FOS和CCND1的表達(dá) (圖2 C、D)。

這些數(shù)據(jù)共同驗證了 GDF15 在調(diào)控 NF-κB 和 ERK 通路以響應(yīng)壓力中的作用。

圖  2

GDF15 在 PDLCs 中受 YAP 調(diào)控

闡明了 GDF15 調(diào)控的信號通路后，研究人員試圖描繪出負(fù)責(zé)力誘導(dǎo)的GDF15上調(diào)的上游信號分子。

YAP/TAZ 作為 Hippo 信號的重要節(jié)點，在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著舉足輕重的作用。由于YAP在乳腺癌細(xì)胞中抑制GDF15的表達(dá)，推測PDLCs中GDF15也可能受到Y(jié)AP的負(fù)調(diào)控。用 YAP 抑制劑 Verteporfin 處理 PDLCs，發(fā)現(xiàn) YAP 抑制后 GDF15 的蛋白質(zhì)水平顯著增加，這證實了 YAP 對 GDF15 的負(fù)調(diào)控作用。

此外，使用MST1/2 抑制劑 XMU-MP-1處理后，抑制了GDF15 的表達(dá)。由于 MST1/2 是內(nèi)源性 MOB1、LATS1/2 和 YAP 磷酸化的激酶，它的抑制會導(dǎo)致 YAP 的激活。因此，這間接證明了 YAP 激活可以抑制 GDF15 的表達(dá)。

實驗結(jié)論：

總之，該研究結(jié)果突出了GDF15是壓力誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的重要介質(zhì)，從而為 OTM 期間 PDLCs 介導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的分子機(jī)制提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：Li S, Li Q, Zhu Y, Hu W. GDF15 induced by compressive force contributes to osteoclast differentiation in human periodontal ligament cells. Exp Cell Res. 2020 Feb 1;387(1):111745. doi: 10.1016/j.yexcr.2019.111745. Epub 2019 Nov 22. PMID: 31765611.
 

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