自噬調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，一般受癌細(xì)胞周圍微環(huán)境的調(diào)控。

在腫瘤微環(huán)境中，0.1-2 dyne/cm² 的流體剪切應(yīng)力（FSS）已被證實(shí)可促進(jìn)腫瘤相關(guān)的血管生成和淋巴管生成，這可能會(huì)改善癌細(xì)胞的移動(dòng)性和侵襲性。研究還表明，1.4 dyne/cm² 層流 FSS 可以顯著增強(qiáng) HCC 細(xì)胞的遷移。然而，機(jī)械應(yīng)力如何調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的機(jī)制仍然知之甚少。

到目前為止，自噬在癌癥進(jìn)展中的作用已被廣泛探索并且對(duì)包括FSS在內(nèi)的多種微環(huán)境刺激具有響應(yīng)性。根據(jù)之前的研究結(jié)果，1.4 dyne/cm² FSS 可以以時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，隨后通過(guò)整合素/細(xì)胞骨架通路促進(jìn) HepG2 細(xì)胞的遷移和侵襲。然而，參與FSS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移的下游通路仍需要進(jìn)一步探索。

近年來(lái)，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）由于與癌細(xì)胞遷移和侵襲的密切關(guān)系而備受關(guān)注。自噬在 EMT 過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。然而，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，尤其是在流體流動(dòng)條件下，自噬和 EMT 之間是否存在相互作用尚不清楚。

鑒于自噬在癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，來(lái)自四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室、四川大學(xué)老年保健和醫(yī)學(xué)研究中心的專家學(xué)者進(jìn)行了深入研究，推斷自噬可能涉及流體剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 EMT。在研究中，對(duì) HepG2 和 QGY-7703 細(xì)胞（人HCC細(xì)胞系）施加1.4 dyne/cm² FSS 以鑒定自噬和 EMT 的發(fā)生。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Molecular Carcinogenesis  題為《Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells》。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

FSS在肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬

為了進(jìn)一步驗(yàn)證FSS對(duì)自噬發(fā)生的影響，對(duì)自噬相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行了研究。如圖1 B、C 所示，EBSS 饑餓誘導(dǎo)的 beclin1、ATG7 和 LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，p62表達(dá)下調(diào)，而p62可被3-MA抑制。

在 HepG2 細(xì)胞中，與靜態(tài)對(duì)照相比，F(xiàn)SS 刺激 1 和 4h 均能顯著上調(diào) beclin1、ATG7 的表達(dá)，以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明 FSS 可以誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞的自噬（圖1 B )。在 QGY-7703 細(xì)胞中可以觀察到類似的結(jié)果（圖1 C）。

不同的是，在HepG2細(xì)胞中，beclin1、ATG7、LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)和p62的下調(diào)在4 h時(shí)更為明顯，而QGY-7703細(xì)胞在1 h時(shí)表達(dá)更明顯。有趣的是，隨著FSS持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，其隨細(xì)胞系的不同而表現(xiàn)出不同的時(shí)間依賴性。
 

圖 1

FSS誘導(dǎo)EMT的發(fā)生

以往的研究表明，EMT的發(fā)生是對(duì)流體剪切應(yīng)力刺激的響應(yīng)。在本研究中，對(duì)HepG2和QGY-7703細(xì)胞分別施加1.4 dyne/cm² 流體剪切應(yīng)力作用1和4 h。如圖2 A所示，與靜態(tài)對(duì)照組相比，F(xiàn)SS在 1 和 4 h 顯著下調(diào)上皮標(biāo)志物 E-cadherin 的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志物 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 的表達(dá)，表明HepG2 細(xì)胞中 EMT 的發(fā)生。
 

圖 2

抑制自噬影響FSS誘導(dǎo)的EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)和定位

最近的研究表明，自噬刺激可以通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的上皮和間充質(zhì)表型之間的轉(zhuǎn)化來(lái)增加細(xì)胞遷移能力。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了自噬是否會(huì)在暴露于 FSS 時(shí)影響 EMT。

如圖2 A所示 , 與相應(yīng)的 FSS 組 (1 和 4 h 組) 相比, 添加自噬抑制劑 3-MA 導(dǎo)致 1 h + 3MA 組的 E-cadherin 水平恢復(fù)上調(diào), 而HepG2 細(xì)胞中 1 h + 3MA 和 4 h + 3MA 組中 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 水平均顯著降低。同樣，當(dāng)3-MA阻斷自噬后，QGY-7703細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin表達(dá)降低，也證實(shí)了EMT的衰減(圖3 A)。
 

圖 3

為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，當(dāng)暴露于 FSS 1h時(shí)，通過(guò)敲低 ATG5 或添加自噬抑制劑 CQ 來(lái)抑制自噬。結(jié)果表明，抑制自噬阻礙了 FSS 誘導(dǎo)的 HCC 細(xì)胞的 EMT。

總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，自噬積極促進(jìn)了 FSS 誘導(dǎo)的 HCC 細(xì)胞 EMT 的發(fā)生。

抑制自噬可阻斷 FSS 誘導(dǎo)的 β-catenin 在細(xì)胞核中的積累

β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是一種間充質(zhì)標(biāo)記物，它從E-鈣粘蛋白分離到細(xì)胞質(zhì)中，然后易位到細(xì)胞核中，對(duì)EMT有重要作用。為了進(jìn)一步證實(shí)自噬在 FSS 誘導(dǎo)的 EMT 中的作用，在 HepG2 和 QGY-7703 細(xì)胞中檢測(cè)了 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)和分布。

結(jié)果顯示，與靜態(tài)對(duì)照相比，β-catenin 的表達(dá)水平在 FSS 刺激 1 h和 4 h內(nèi)上調(diào)，而隨著 3-MA 在兩種細(xì)胞中的加入，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)明顯減少并易位至細(xì)胞膜，表明FSS誘導(dǎo)的自噬可以誘導(dǎo)β-catenin的核易位。

這些結(jié)果表明 FSS 可以促進(jìn) EMT 的發(fā)生，而 EMT 可以通過(guò)抑制自噬而減弱。

抑制自噬損害 FSS 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移

自噬已被證實(shí)正調(diào)控EMT的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)假設(shè)自噬可能有助于HCC細(xì)胞的遷移。該研究采用F-肌動(dòng)蛋白染色檢測(cè)HCC細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，在 FSS 條件下，自噬的抑制顯著阻礙了 F-肌動(dòng)蛋白的聚集和重組，這是細(xì)胞遷移所必需的。

為了進(jìn)一步證實(shí)自噬對(duì) EMT 的影響，進(jìn)行了傷口愈合試驗(yàn)以檢測(cè) HCC 細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)暴露于流體剪切應(yīng)力時(shí)，在HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)1和4 h組細(xì)胞的遷移距離分別長(zhǎng)約1.4和1.5倍，而在QGY-7703細(xì)胞中，在24 h時(shí)，其遷移距離分別是對(duì)照組的1.2倍和1.3倍 (圖 4)。

因此，1.4 dyne/cm2 FSS對(duì)HCC細(xì)胞的遷移有重要作用。然而，與 1 h和 4 h組相比，3-MA 的添加分別顯著降低了49%和93%的HepG2細(xì)胞遷移距離（圖 4）。同樣，QGY-7703細(xì)胞的遷移距離分別降低了64%和47%，表明自噬參與了 FSS 誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，可能是通過(guò)誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生。
 

圖 4

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

總之，該研究表明自噬參與了 FSS 誘導(dǎo)的 EMT，可以積極促進(jìn) HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲。該研究結(jié)果提供了一種新的見解，用于說(shuō)明肝細(xì)胞癌機(jī)械微環(huán)境中自噬和 EMT 之間的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：Su G, Feng T, Pei T, Yang F, Sun D, Yu H, Wang X, Gao W, He J, Shen Y, Liu X. Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells. Mol Carcinog. 2021 Sep;60(9):607-619. doi: 10.1002/mc.23327. Epub 2021 Jun 9. PMID: 34107107.

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