p62介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的自噬

內(nèi)皮功能障礙作為一種病理狀態(tài)，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的一個(gè)關(guān)鍵事件。動(dòng)脈壁中的脂質(zhì)積累是動(dòng)脈粥樣硬化的明確特征之一，血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的早期事件。

自噬是一種保守的細(xì)胞過程，可降解和回收受損的細(xì)胞內(nèi)聚集體和細(xì)胞器。自噬過程伴隨巨噬細(xì)胞的增加。在人類中，自噬通過極化線粒體和阻止細(xì)胞色素c的釋放，也為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的細(xì)胞提供了一種保護(hù)，以對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激。動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的特征是自噬受損。據(jù)報(bào)道，在動(dòng)脈粥樣硬化期間，各種機(jī)制涉及自噬受損或自噬相關(guān)的分子變化。

眾所周知的自噬受體 p62/SQSTM1 (p62) 在細(xì)胞的選擇性自噬和細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。由于p62將包括脂質(zhì)在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)自噬物質(zhì)運(yùn)輸?shù)阶允审w進(jìn)行降解，自噬的破壞會(huì)導(dǎo)致 p62 積累。p62水平升高通常被認(rèn)為是自噬活性受到抑制的標(biāo)志。

有兩種主要的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和自噬-溶酶體系統(tǒng)。這些系統(tǒng)在檢測(cè)和去除錯(cuò)誤折疊蛋白方面發(fā)揮著重要的監(jiān)視作用。由于 p62 作為一個(gè)橋梁，蛋白酶體抑制可以激活自噬。由于泛素化是可逆的，它在自噬中具有雙向作用，泛素化也及時(shí)參與調(diào)節(jié)自噬。

盡管有報(bào)道稱在受損細(xì)胞條件下p62水平升高表明自噬缺陷，但人們認(rèn)為p62的積累可能是一種適應(yīng)不良或細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化中�；�于此，來自韓國尚志大學(xué)醫(yī)學(xué)院、延世大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科系、京畿大學(xué)生命科學(xué)系等的專家學(xué)者進(jìn)行了深入研究，旨在闡明在動(dòng)脈粥樣硬化條件下 p62 介導(dǎo)的自噬在人內(nèi)皮細(xì)胞 (ECs ) 中的作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在 International Journal Molecular Sciences 題為《P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin–Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis》。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

oxLDL 在共培養(yǎng)的 HUVEC 和 THP-1 細(xì)胞中誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)和炎癥

為了模擬動(dòng)脈粥樣硬化條件下的血管狀況，共培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 和人單核細(xì)胞 THP-1 細(xì)胞，并用氧化低密度脂蛋白 (oxLDL、50 µg/mL) 處理 6、12、24 或 48 小時(shí)。然后從共培養(yǎng)物中收集上清液并使用 ELISA 測(cè)量 C1q 的水平，C1q 是一種先天免疫分子，是補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑的一部分。

在oxLDL處理后24小時(shí)，C1q仍在增加，但沒有進(jìn)一步增加 (圖1 A)。接下來，從共培養(yǎng)物中分離出的細(xì)胞裂解液在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行分析。值得注意的是，HUVECs 中的 C1q 蛋白水平與分泌的 C1q 水平相似 (圖1 B)。

此外，還分析了 oxLDL作用下THP-1細(xì)胞中被裂解的IL-1β蛋白水平，發(fā)現(xiàn)oxLDL處理后24小時(shí)，IL-1β被裂解最高，48小時(shí)時(shí)略有下降 (圖1 C)。采用BODIPY對(duì)HUVECs和THP-1細(xì)胞進(jìn)行染色，研究oxLDL處理后各細(xì)胞的脂質(zhì)沉積情況。在共培養(yǎng)的 HUVECs 和 THP-1 細(xì)胞中，在 0、6 和 24 小時(shí)檢測(cè)到 oxLDL 處理后的脂質(zhì)負(fù)荷，脂質(zhì)積累在 24 小時(shí)而不是在 6 小時(shí)時(shí)顯著增加 (圖1 D)。
 

圖 1  oxLDL 在共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的暴露

自噬被誘導(dǎo)但在動(dòng)脈粥樣硬化條件下發(fā)生功能障礙

首先，檢測(cè)共培養(yǎng)中HUVECs 和 THP-1 細(xì)胞的自噬水平。自噬陽性 HUVECs 的數(shù)量在 oxLDL 暴露后 8 h 顯著增加，在 24 h 達(dá)到峰值，然后在 48 h 下降 (圖2 A)。在THP-1細(xì)胞中，自噬陽性細(xì)胞的數(shù)量在8 h時(shí)增加，但在48 h后仍保持在較高水平 (圖2 B)。

然而，這項(xiàng)研究主要集中在暴露于oxLDL的動(dòng)脈粥樣硬化條件下受損的HUVECs。如圖1 D所示，確定脂質(zhì)被加載到HUVECs中，從而研究了自噬在清除 HUVECs 中沉積的脂質(zhì)中的作用。通過蛋白質(zhì)印跡分析了 HUVECs 中自噬相關(guān)蛋白Beclin1 、p62、LC3-II 的水平 (圖2 D)。

結(jié)果表明，與 THP-1 細(xì)胞相比，beclin-1 和 p62 蛋白水平均呈時(shí)間依賴性增加，但略有延遲。此外，在 oxLDL 暴露 24 小時(shí)后，LC3-II 的水平增加，但在 48 小時(shí)后下降。此外，溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2 (LAMP2) 蛋白水平逆轉(zhuǎn)為 p62 蛋白水平。出乎意料的是，在暴露于 oxLDL 后，LAMP2 的水平以時(shí)間依賴性方式降低。
 

圖 2  oxLDL暴露時(shí)共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的自噬啟動(dòng)

下調(diào) p62 誘導(dǎo)替代降解系統(tǒng)

為了更好地了解自噬和自噬受損在動(dòng)脈粥樣硬化條件下的作用，在 oxLDL 暴露前，p62被siRNA沉默48小時(shí)。因此，當(dāng)與 oxLDL 共培養(yǎng) 24 小時(shí)時(shí)，siRNA處理的HUVECs中p62 mRNA 和蛋白水平均下調(diào)。長(zhǎng)期暴露于oxLDL可損害內(nèi)皮細(xì)胞的自噬。

THP-1與HUVECs共培養(yǎng)時(shí)，沉默p62, HUVECs中的LC3-II降低，負(fù)載的脂質(zhì)相應(yīng)增加。同樣，代表自噬執(zhí)行的 LC3 陽性水平受到 p62 下調(diào)和蛋白酶體系統(tǒng)抑制劑的阻礙。與 LC3 相反，oxLDL暴露降低了LAMP2 mRNA水平，p62的下調(diào)沒有顯著改變LAMP2 mRNA水平。然而，LAMP2 的蛋白質(zhì)水平因 p62 下調(diào)而升高。此外，siRNA-p62 處理的 HUVECs 中 LAMP2 陽性信號(hào)略有增強(qiáng)，足以克服 oxLDL 損傷。

E3 連接酶參與動(dòng)脈粥樣硬化條件下的自噬

通過qPCR在mRNA水平檢測(cè)E3連接酶的變化。Cul4 是 CRL E3 連接酶家族的成員，在oxLDL暴露于HUVECs后24 h表達(dá)增加，48 h表達(dá)減少 (圖3 B)。此外，在 p62 沉默的 HUVECs 中 mRNA 水平降低。另一種 E3 連接酶 NEDD4 是 HECT E3 連接酶的一個(gè)組成部分，其 mRNA 水平在oxLDL處理或p62敲低時(shí)沒有變化 (圖3 C)。

為了進(jìn)一步闡明自噬和蛋白酶體泛素系統(tǒng)在清除致動(dòng)脈粥樣硬化物質(zhì)中的作用，將 p62-siRNA、MG132（蛋白酶體抑制劑）、heclin（HECT E3 連接酶抑制劑）和 MLN4924（CRL E3 連接酶抑制劑）注入暴露于oxLDL的細(xì)胞中 (圖3 D)。通過沉默 p62，與 si 對(duì)照處理的 HUVECs 相比，多聚泛素化蛋白FK2 檢測(cè)到的多泛素化蛋白是豐富的。相反，用 MG132 和 MLN4924 處理減少了多泛素化蛋白，但用 HECT E3 連接酶抑制劑 Heclin 處理沒有改變 (圖3 D)。
 

圖 3  E3 連接酶參與自噬

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

總的來說，這項(xiàng)研究探索了p62介導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)條件下的自噬。暴露于 oxLDL 后，脂質(zhì)在 ECs 中積累并誘導(dǎo)自噬，但在長(zhǎng)期暴露于 oxLDL 后未能降解。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過多會(huì)導(dǎo)致溶酶體功能障礙，蛋白酶體系統(tǒng)可以幫助緩解這一問題。

這項(xiàng)研究證明了在動(dòng)脈粥樣硬化條件下溶酶體和蛋白酶體降解之間的相互作用，而未來也需要進(jìn)一步研究 E3 連接酶抑制劑的靶點(diǎn)、每種 E3 連接酶的作用以及特定的 E3 連接酶與自噬相關(guān)分子之間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Kim S, Lee W, Cho K. P62 Links the Autophagy Pathway and the Ubiquitin-Proteasome System in Endothelial Cells during Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2021 Jul 21;22(15):7791. doi: 10.3390/ijms22157791. PMID: 34360560; PMCID: PMC8346161.

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