Nanolive無標記成像方法在腫瘤細胞和免疫細胞3D成像的應(yīng)用

01  要點概括

1.對腫瘤細胞進行連續(xù)、長期、無標記的活細胞成像，了解它們對不同治療的反應(yīng)以及它們與免疫細胞的相互作用，對于理解藥物治療效果、免疫反應(yīng)過程以及導(dǎo)致疾病進展的因素等至關(guān)重要。
 

2. Nanolive的無標記成像方法允許研究人員以高時空分辨率、不受干擾、無光毒性的方式監(jiān)測巨噬細胞、自然殺傷細胞和T細胞對癌細胞的協(xié)同反應(yīng)
 

3. Nanolive技術(shù)使得免疫細胞和癌細胞相互作用過程中發(fā)生的細胞形態(tài)和行為包括入侵、遷移和轉(zhuǎn)移到細胞死亡的疾病過程的各個階段的變化變得可視化。還可以對細胞增殖進行定量分析，使研究人員能夠比較癌細胞對不同抗體或免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)。

4. Nanolive技術(shù)無標記，無光毒性，使連續(xù)監(jiān)測活細胞成為可能。因此，它是跟蹤細胞共培養(yǎng)中發(fā)生的動態(tài)互動的理想選擇。
 

02  腫瘤細胞和免疫細胞互作3D無標記成像

本應(yīng)用有六個案例：檢查T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞之間的相互作用（案例1）；Nanolive用于T細胞對癌細胞的反應(yīng)（案例2）以及T細胞和巨噬細胞之間發(fā)生的相互作用（案例3）進行成像；Nanolive活細胞成像用于監(jiān)測癌細胞對有前景的抗體-藥物結(jié)合物（ADC）產(chǎn)品（案例4）和新型雙特異性抗體（案例5和6）。
 

案例一：細胞參與天性和適應(yīng)性免疫

背景

Nanolive技術(shù)無標記，無光毒性，使連續(xù)監(jiān)測活細胞成為可能，非常適合高時空分辨率跟蹤在共培養(yǎng)中發(fā)生的相互作用，以及先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中不同細胞類型之間的動態(tài)互作，且不受基于熒光的成像或終點分析的限制。
 

試驗方法：

從骨髓中分離提前刺激來自C57BL/6小鼠的抗原呈遞樹突狀細胞和巨噬細胞并進行體外分化。然后將它們與來自O(shè)T-I小鼠的新鮮分離的幼稚T細胞一起孵育。使用3D Cell Explorer每隔6秒采集一張圖像，持續(xù)約11分鐘。

試驗結(jié)果：
 

 

觀察內(nèi)容

1. 由于這三種細胞的大小、密度以及折射率（RI）的不同，我們可以清楚地將它們區(qū)分開來。T細胞是最小和最密集的，因此它們在RI圖像上看起來最亮。巨噬細胞則相反；這些細胞很大，因此在RI圖像中它們較暗。樹突狀細胞通過其大量的膜突起很容易區(qū)分。
 

2. Nanolive活細胞成像的高時空分辨率使我們能夠觀察不同細胞類型之間的行為差異。視頻中最顯著的特征之一是樹突狀細胞膜突起的動態(tài)行為。細胞膜不斷以快速、隨機的方式延伸出細胞表面，這種行為很可能與細胞感知外界環(huán)境信號有關(guān)。
 

3. 樹突狀細胞包膜含有檢測細胞因子、病原體相關(guān)和損傷相關(guān)分子模式的受體，抑制這些受體并觀察其對樹突狀細胞行為的影響是未來可能研究的課題。

 

案例二：T細胞和癌細胞互作

背景

免疫系統(tǒng)與癌癥之間的關(guān)系是復(fù)雜而動態(tài)的。熒光顯微鏡是研究免疫細胞和癌細胞之間相互作用最常用的方法，但它有許多局限性，脆弱的原代免疫細胞受到耗時、復(fù)雜和昂貴的染色步驟的干擾，受到大量光毒性。相比之下，Nanolive成像提供了一種高分辨率、無標標記的方式對免疫細胞和癌細胞之間的相互作用進行成像。

試驗方法：

使用從OT-I小鼠分離的T細胞，其攜帶對卵清蛋白殘基257-264（SIINFEKL肽）有反應(yīng)的細胞受體，與來自MC38-OVA細胞系和表達卵清蛋白（OVA）抗原的結(jié)腸癌細胞一起孵育。

試驗結(jié)果：

觀察內(nèi)容

1. T細胞和癌細胞之間的相互作用: T細胞接近并連接到結(jié)腸癌細胞表面（A）。癌細胞抵抗這種誘導(dǎo)凋亡的接觸，但隨后吸引了更多的T細胞。
2. 三個T細胞現(xiàn)在包圍著癌細胞，并通過不止一個T細胞（B）進行接觸。
3. 細胞凋亡被激活，癌細胞收縮并開始失去其結(jié)構(gòu)（C）。
4. 癌細胞被中和（D）。
 

案例三：T細胞和巨噬細胞互作

背景

Nanolive為確定T細胞和巨噬細胞相互作用的基本動力學(xué)提供了一個良好的解決方案，使復(fù)雜的細胞間相互作用能夠在空間和時間上以清晰的對比度和高分辨率被捕獲，從而允許對細胞內(nèi)的動態(tài)的細節(jié)進行檢查。

試驗方法：

從C57BL/6小鼠中分離巨噬細胞，并用卵清蛋白肽、γ-干擾素和脂多糖處理以誘導(dǎo)抗原呈遞。從OT-1小鼠中分離T細胞。使用3D Cell Explorer每隔6秒采集一張圖像，持續(xù)16小時。對z軸上的數(shù)據(jù)應(yīng)用后處理數(shù)字著色標尺，將空間信息添加到我們的圖像中（靠近培養(yǎng)皿底部的細胞為藍色，而遠離培養(yǎng)皿的細胞為粉紅色）

試驗結(jié)果：

觀察內(nèi)容

1. 由于Nanolive技術(shù)的非侵入性和允許長時間連續(xù)成像，能夠捕捉到T細胞介導(dǎo)的巨噬細胞死亡和巨噬細胞-巨噬細胞循環(huán)的鏡頭。

2. 細胞類型通過其獨特的形態(tài)很容易識別：巨噬細胞比T細胞大。兩個T細胞接近并接觸巨噬細胞（A）。這種接觸足以使T細胞識別存在于巨噬細胞表面的抗原（B）并引發(fā)凋亡（C）。之后，相鄰的巨噬細胞識別細胞死亡，并開始吞噬（D）。

3. Nanolive高時空分辨率確保不會遺漏細節(jié)，甚至觀察到從死細胞到活細胞（E）的囊泡轉(zhuǎn)移。

4. 在后期數(shù)字化處理視頻突出Nanolive技術(shù)的另一個優(yōu)勢：添加有關(guān)細胞深度等信息。
 

案例四：檢測抗腫瘤治療的效果

背景

不斷增殖是癌癥的重要特征之一�？贵w-藥物結(jié)合物（ADC）是近年來發(fā)展起來的一種新型癌癥治療藥物。ADC將單克隆抗體的靶向特異性與細胞毒性藥物的抗癌能力結(jié)合起來，使區(qū)分健康細胞和癌細胞成為可能，并大大減少了常規(guī)抗癌治療的副作用。Nanolive的非侵入性、無標記和允許長時間連續(xù)監(jiān)測細胞增殖；保證了測試抗癌治療有效性和安全性。本案例研究是與瑞士生物技術(shù)公司NBE Therapeutics合作進行的。

試驗方法：

腫瘤特異性ADC和同型ADC，兩種ADC在小鼠乳腺癌細胞系上進行了測試。使用Nanolive每隔2秒拍攝一次圖像，持續(xù)60小時。將細胞隨時間的增殖量化為視野中細胞所占表面積的百分比（%融合度），繪制為線圖并覆蓋在處理上。
 

試驗結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

1. Nanolive成像60小時，連續(xù)監(jiān)測細胞（每2秒一張圖像）。從得到的圖像可以很容易地計算出細胞融合率，從而可以量化處理過的細胞群的生長或衰退，并將其與實驗對照的性能進行比較。在本病例研究中，暴露于對照同型ADC的細胞分裂不受干擾（A），而暴露于腫瘤特異性性ADC的細胞（B）在同一時期內(nèi)死亡（給藥后34小時30分鐘）。

2. 除了能夠進行簡單的細胞增殖分析外，Nanolive也能夠觀察細胞在反應(yīng)過程中發(fā)生的形態(tài)變化，提供細胞被殺死機制的參照。

3. 在添加腫瘤特異性ADC（白色箭頭，A，B）后早期觀察到內(nèi)吞作用（空泡形成）增加。脂滴（細胞內(nèi)的白色小結(jié)構(gòu)）的分布也發(fā)生了變化，在細胞凋亡完成之前聚集在細胞核周圍（C）。

4. 活細胞增殖分析與單細胞分辨率的結(jié)合是一個強大的組合，可以用來測試多種抗癌藥物的有效性和安全性。未來的研究可以考慮對每個細胞面積/質(zhì)量/體積形成的液泡的數(shù)量進行量化，確定是否達到某個閾值才能完成細胞凋亡。
 

案例五：使用雙異性抗體藥物提高細胞毒性T細胞的療效

背景

細胞毒性T細胞是一種強大的效應(yīng)T細胞，能夠殺死帶有抗原復(fù)合物（肽-MHC）的靶細胞，該抗原復(fù)合物由T細胞受體（TCR）識別。然而，大多數(shù)T細胞無法識別和殺死腫瘤細胞，因為其TCR缺乏腫瘤特異性。通過在癌細胞上使用針對腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的雙特異性抗體和T細胞上的CD3蛋白復(fù)合物結(jié)合，可以獨立于其TCR的特異性來定向和激活針對腫瘤細胞的任何T細胞。我們使用CX-A的自動網(wǎng)格掃描成像模式，在高時空分辨率下實時跟蹤這一過程。這項研究是與瑞士生物技術(shù)公司Light Chain Bioscience合作進行的。
 

試驗方法：

人類癌細胞與設(shè)計用于靶向癌細胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和T細胞上的CD3復(fù)合物的雙特異性抗體混合，比例為5 T細胞：1癌細胞。使用Nanolive CX-A上的5x5網(wǎng)格掃描模式，以4分鐘30秒每幀的速度采集圖像。隨后拼接生成的圖像以顯示細胞的群體水平反應(yīng)。
 

試驗結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

CX-A的網(wǎng)格掃描模式產(chǎn)生的大視場使觀察TAAxCD3 bsAb對T細胞/癌細胞相互作用的影響成為可能。TAAxCD3 bsAb能夠使T細胞更接近其目標癌細胞，從而使T細胞更活躍，T細胞介導(dǎo)腫瘤細胞殺傷。
 

案例六：檢測靶向雙特異性抗體CD47的療效

背景

CD47使癌細胞能夠逃避免疫監(jiān)視和先天免疫細胞（如巨噬細胞）的殺傷。免疫治療希望使用抗CD47抗體靶向和抑制CD47-SIRPα相互作用，進而激活先天免疫，巨噬細胞破壞癌細胞。該試驗展示了Nanolive的無標記成像在臨床前測試抗CD47雙特異性抗體效力。這項研究是與瑞士Light Chain生物科學(xué)公司合作進行的。
 

試驗方法：

將人腫瘤細胞與（1）具有針對腫瘤相關(guān)抗原的高親和力TAAxCD47雙特異性抗體（治療組）或（2）低親和力CD47 bsAb（對照組）混合，并在人單核細胞源性巨噬細胞存在下培養(yǎng)3小時。使用Nanolive以每30秒一幅圖像的速度獲取圖像。
 

試驗結(jié)果：

 

觀察內(nèi)容

由于CD47（A）的阻斷，暴露于雙特異性抗體的癌細胞被巨噬細胞吞噬并迅速降解。相反，暴露于對照抗體的癌細胞抵抗來自巨噬細胞的攻擊，巨噬細胞的吞噬活性（B）受到阻礙。上面的詳細畫面說明了Nanolive活細胞成像如何評估癌癥免疫治療的新抗體。圖像的卓越分辨率允許觀察巨噬細胞細胞質(zhì)中被吞噬的癌細胞的消化情況（部分視頻放大）。
 

結(jié)論：

1.自動化、無標記成像，加快了數(shù)據(jù)收集；
2.捕捉細胞對藥物的真實反應(yīng)，而不是細胞對外界的反應(yīng)（例如光毒性），保證數(shù)據(jù)的真實性；
3.產(chǎn)生連續(xù)數(shù)據(jù)，允許細胞響應(yīng)的時間分辨率；
4.以定量、公正的方式驗證功能；
5.由于其捕獲多種生物過程的能力，允許進行同時觀察。
 

03   參考文獻

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