原代細(xì)胞 (primary cell) 是指從機(jī)體的組織(如人體組織、小鼠組織等)經(jīng)特定方法獲得單個(gè)細(xì)胞,并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞。原代細(xì)胞離體時(shí)間較短,生物學(xué)特性未發(fā)生較大變化,仍保有機(jī)體組織的遺傳特征,能更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀態(tài),因此可獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù),更適合用于藥物測試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。
原代細(xì)胞分離是指使用酶、螯合劑(常用EDTA)以及機(jī)械方法處理動(dòng)物組織,使其分散為單細(xì)胞懸液樣品,后續(xù)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系下使分離的原代細(xì)胞進(jìn)行生存、生長和繁殖的過程。針對(duì)不同物種的不同組織類型,其具體的操作流程也要進(jìn)行調(diào)整,常規(guī)原代細(xì)胞分離流程為取樣→預(yù)處理→分離處理→過濾清洗→后處理。
01
取樣→預(yù)處理
取樣是原代單細(xì)胞懸液制備非常重要的一步,其質(zhì)量會(huì)直接影響到后續(xù)處理效果。
操作時(shí),首先根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求麻醉或處死動(dòng)物后進(jìn)行消毒、固定并切開相應(yīng)位置皮膚暴露目的組織。
(▲暴露目的組織)
同時(shí)不同組織類型,取樣時(shí)也有細(xì)微差別。
其次操作過程中有以下幾點(diǎn)也需要注意:
拿到樣本后針對(duì)不同分離流程選擇不同的預(yù)處理方式(如將腫瘤組織剪切到2-4mm左右的小塊),如血液細(xì)胞等已經(jīng)是單細(xì)胞懸液的樣本在簡單的離心換液過后就可以直接使用了,其他類型的組織還需要進(jìn)一步解離。
(▲組織預(yù)處理)
02
分離處理
常規(guī)組織處理一般有兩種方法,分別是通過物理機(jī)械剪切和化學(xué)生物酶解來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。
物理機(jī)械剪切是使用勻漿機(jī)打散組織或者使用剪刀、銅網(wǎng)或者組織研磨器進(jìn)行的剪碎法、網(wǎng)搓法和研磨法。這種方法成本低,操作簡單、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷巨大,而且細(xì)胞分散效果不盡人意,只適用于一些質(zhì)地軟且較為松散的軟組織。
化學(xué)生物酶解法是組織樣本預(yù)處理之后,在酶的作用下,破壞組織間的膠原纖維和彈性纖維,同時(shí)水解粘多糖及其他連接細(xì)胞間的蛋白質(zhì);或者通過EDTA等化學(xué)物質(zhì)與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞,尤其對(duì)上皮組織的分散效果很好。
使用酶解體系進(jìn)行組織解離時(shí)還需注意酶的選擇和配比,最常使用胰蛋白酶和膠原酶進(jìn)行處理。其中胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)有水解作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)消化溶解而使細(xì)胞分散開,適用于多種組織。
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶,對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適用于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。不同的膠原酶適用的組織也會(huì)有不同。
除上述兩種最常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶這種解離效果強(qiáng)但容易造成細(xì)胞損傷以及解離效果弱,但對(duì)細(xì)胞損傷較小的裂解酶,可以根據(jù)實(shí)際樣本的情況進(jìn)調(diào)整,或者通過復(fù)配聯(lián)用達(dá)到更好的效果,例如可以使用透明質(zhì)酸酶與膠原酶聯(lián)用消化細(xì)胞間基質(zhì)等。
同時(shí),在進(jìn)行消化處理的時(shí)候佐以機(jī)械剪切,便能使組織分散得更加均勻,樣本處理效果更好。另外實(shí)驗(yàn)操作中還需要注意以下幾點(diǎn):
原代細(xì)胞分離過程復(fù)雜,同時(shí)整個(gè)分離處理過程都需要人工參與,機(jī)械剪切過程難以控制實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。隨著科技的進(jìn)步,瑞沃德單細(xì)胞懸液制備儀輕松化解這一難題,自主研發(fā)的組織處理管、酶解試劑盒和內(nèi)置不同組織優(yōu)化處理程序,可將組織制備成高活性單細(xì)胞懸液或組織勻漿。
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根據(jù)實(shí)際樣本可在15-30min內(nèi)完成活性高、均一性好的單細(xì)胞懸液制備,大大增加實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。擁有獨(dú)立運(yùn)行的四通道,搭配加熱套實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)處理,提高組織處理效率。廣泛應(yīng)用在單細(xì)胞測序、原代細(xì)胞培養(yǎng)、流式分析、細(xì)胞分選、細(xì)胞治療等研究領(lǐng)域。
03
過濾清洗→后處理
在分離處理操作結(jié)束后要對(duì)樣品進(jìn)行過濾、離心、換液,對(duì)獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力分析,終止反應(yīng)并將細(xì)胞置于培養(yǎng)體系或相應(yīng)的緩沖體系中。
(▲活細(xì)胞計(jì)數(shù))
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用可以對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)計(jì)數(shù),瑞沃德C100自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可配合多熒光通道,對(duì)懸液中的細(xì)胞進(jìn)行定量分析,并同時(shí)顯示明場及熒光圖像,清晰呈現(xiàn)計(jì)數(shù)結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)。適用于免疫學(xué)及疫苗開發(fā)、細(xì)胞治療、腫瘤研究、干細(xì)胞及代謝研究等研究領(lǐng)域的細(xì)胞分析。
細(xì)胞培養(yǎng)是原代細(xì)胞分離流程最后一步,瑞沃德二氧化碳培養(yǎng)箱,可精準(zhǔn)控制溫度、二氧化碳濃度,并且是維持高濕度環(huán)境的高性能細(xì)胞培養(yǎng)箱。HEPA高效過濾器可有效去除空氣中的微粒污染,140℃高溫干熱滅菌功能可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)箱的定期滅菌維護(hù),為原代細(xì)胞樣品提供穩(wěn)定潔凈的培養(yǎng)環(huán)境。