Circulation文獻解讀：n-3 PUFAs通過RvE1/ChemR23軸減少主動脈瓣狹窄

主動脈瓣狹窄（AVS）是最常見的瓣膜性心臟病，由于主動脈瓣瓣葉增厚和鈣化，導致主動脈瓣進行性狹窄，是心力衰竭和心血管死亡率增加的主要原因。omega-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs）在心血管預防方面具有有益作用，n-3 PUFAs作為合成特殊促分解介質(zhì)的底物，在心血管疾病中具有抗炎、促分解和組織修飾特性。然而，n-3PUFAs和專門的促分解介質(zhì)對AVS的影響尚不明確，Peter Sjovall研究團隊對96例主動脈瓣置換術患者的三尖瓣主動脈瓣進行脂質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析，并以Apoe^-/-和C57BL/6J小鼠主動脈瓣線損傷為模型確定n-3PUFAs衍生的特殊促分解介質(zhì)（SPMs）通過RvE1/ChemR23軸介導AVS進展的機制，提示n-3 PUFAs治療可能為預防AVS提供新的治療機會。

 
人主動脈瓣n-3不飽和脂肪酸含量

對21例非鈣化主動脈瓣組織進行氣相色譜分析測定人主動脈瓣中的脂肪酸含量，對比來自同一主動脈瓣的非鈣化組織和鈣化組織發(fā)現(xiàn)，非鈣化部分的HS-omega-3指數(shù)（n-3 PUFA含量的整體測量）明顯高于主動脈瓣鈣化部分（圖1B）。然而，與快速進展的AVS患者相比，有緩慢AVS進展史的患者在非鈣化主動脈瓣區(qū)域顯示更高的HSomega- 3（圖1C）。此外，高HS -3指數(shù)和低HS-3指數(shù)患者的轉(zhuǎn)錄組主成分分析結(jié)果顯示，在非鈣化和鈣化的人主動脈瓣組織中存在差異（圖1D）。

Resolvins 和白三烯在鈣化的主動脈瓣組織中失調(diào)

由于主動脈瓣脂肪酸含量的變化可能會改變下游脂質(zhì)介質(zhì)形成的底物可用性，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術進行靶向脂質(zhì)介質(zhì)的研究，在人非鈣化和鈣化瓣膜組織中鑒定了2個n-3 PUFA衍生的SPMs, DHA衍生的RvD3和EPA衍生的RvE1，多反應監(jiān)測（MRM）定量結(jié)果顯示，與非鈣化組織相比，鈣化組織中的RvE1水平顯著降低（圖2A和2B），且鈣化組織中促炎的n-6 PUFA衍生脂質(zhì)介質(zhì)白三烯B4（LTB4）明顯高于非鈣化組織（圖2D）。

RvE1受體ChemR23在人主動脈瓣中表達，RvE1在體外降低人瓣膜間質(zhì)細胞鈣化

在64例人主動脈瓣的非鈣化組織中研究了SPM受體ChemR23、GPR18、GPR32和ALX/FPR2的mRNA水平�；�因表達分析顯示，編碼RvE1的ChemR23受體是人類主動脈瓣主要的SPM受體（圖3A），此外，免疫組化檢測到ChemR23蛋白表達廣泛分布于人鈣化和非鈣化區(qū)域主動脈瓣的纖維層、海綿體層、心室層（圖3B）。通過免疫熒光與瓣膜間質(zhì)細胞（VIC）標記物平滑肌肌動蛋白和波形蛋白共定位（圖3C-D）�？紤]到ChemR23在VIC中的表達以及鈣化瓣膜組織中RvE1水平的降低，接下來研究了RvE1對高磷酸鹽介質(zhì)誘導VIC鈣化的影響，結(jié)果顯示，與對照相比，RvE1顯著降低了人VIC的鈣化（圖3E-F）。

Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠主動脈瓣瓣葉中n-3 PUFA濃度較高

構建秀麗隱桿線蟲基因 Fat-1^tg （編碼一種將n-6轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs的去飽和酶）在Apoe^−/−小鼠中表達使得內(nèi)源性產(chǎn)生n-3 PUFA，并借助飛行時間二次離子質(zhì)譜對 Fat-1^tg×Apoe^−/−和Apoe^−/−小鼠的主動脈瓣葉區(qū)域測量 n-3 PUFA 和 n-6 PUFA。光學顯微鏡觀察主動脈根部，發(fā)現(xiàn)組織表面有磷脂酰乙醇胺，動脈粥樣硬化斑塊區(qū)域有膽固醇，無組織區(qū)域有血紅素，表明有血液殘留（圖4A-C）。然后通過從專門對應于瓣葉區(qū)域的特定部位生成質(zhì)譜來提取空間解析的脂肪酸數(shù)據(jù)（圖4B-C）。對瓣葉中心區(qū)域所有質(zhì)譜中脂肪酸信號強度的分析表明，與Apoe^−/−小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg×Apoe^−/−小鼠n-3 PUFA（EPA，二十二碳五烯酸）的相對濃度顯著升高，而 n-6 PUFA（花生四烯酸）的相對濃度顯著降低（圖4D-E），且Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠心室心肌HS-omega-3指數(shù)明顯升高（圖4F）。

Fat-1^tg中止或ChemR23^−/−會增加Apoe^−/−小鼠的超聲心動圖進展

在 52、64 和 72 周齡分別評估經(jīng)主動脈峰值速度 （Vmax） 和主動脈瓣尖瓣分離，提示Apoe^−/−小鼠的 Vmax 隨著年齡逐漸增加（圖5A）。Fat-1^tg×Apoe^−/−小鼠表現(xiàn)出 Vmax 顯著降低（圖 5A），主動脈血管顯著增加，與非轉(zhuǎn)基因 Apoe^−/−小鼠相比，72 周時瓣尖分離和左心室質(zhì)量減少（圖 5B）。根據(jù)對人主動脈瓣分析獲得的結(jié)果，RvE1/ChemR23 軸被Apoe^−/−模型中 ChemR23 的基因缺失而消除，以確定n-3PUFAs對主動脈瓣產(chǎn)生有益影響的機制。與Apoe^−/−×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^−/−×ChemR23^−/−小鼠表現(xiàn)出 Vmax 顯著增加、瓣尖分離減少，將 ChemR23 受體作為主動脈瓣保護的傳感器（圖5A-B）。為了確定增加的 n-3 PUFAs的有益作用是否通過ChemR23 轉(zhuǎn)導，在Apoe^−/−×ChemR23^−/−小鼠中引入 Fat-1^tg。在 Fat-1^tg Apoe^−/−（降低 Vmax 和增加主動脈瓣分離）中觀察到的有益作用在 ChemR23^−/−小鼠中完全消失（圖 5A-B），表明n-3 PUFAs衍生的RvE1信號通過ChemR23在疾病進展發(fā)揮直接作用。Vmax與尖瓣分離呈負相關，提示Vmax 增加是尖瓣分離減少的結(jié)果。

Fat-1^tg 減少主動脈瓣葉面積，ChemR23^-/-增加 Apoe^-/-小鼠的主動脈瓣葉面積

形態(tài)學分析提示Fat-1^tg通過 ChemR23 對主動脈瓣葉面積產(chǎn)生有益影響。與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg Apoe^-/-小鼠的主動脈瓣葉面積減少。相反，與 Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^-/-×ChemR23^-/-主動脈瓣瓣葉面積顯著增加（圖6A）。此外，在調(diào)整后的模型中，主動脈瓣瓣葉面積與主動脈瓣瓣葉厚度顯著相關（圖6B），與超聲心動圖測量的Vmax顯著相關（圖6C），與尖瓣分離顯著相反（圖6D）。定量變量的不顯著偏相關提示基因型作為這些關聯(lián)的預測因子（圖6B-D）。

Fat-1^tg 減少小葉鈣化而ChemR23^-/-增加Apoe^-/-小鼠的小葉鈣化

由于鈣化是人AVS的主要成分，且與人類主動脈瓣非鈣化區(qū)相比，鈣化區(qū)n-3 PUFA含量和RvE1形成減少，因此通過茜素紅染色隨后分析4組小鼠主動脈瓣瓣葉鈣化情況，結(jié)果表明，與 Apoe^-/-ChemR23^+/+小鼠相比，F(xiàn)at-1^tg Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠的鈣化顯著降低；與 Apoe^-/-×ChemR23^+/+小鼠相比，Apoe^-/-×ChemR23^-/-小鼠無論 Fat-1^tg存在與否都表現(xiàn)出顯著更高的小葉鈣化（圖7A）。此外，小葉鈣化與主動脈瓣小葉面積、Vmax 和瓣葉分離的相關性在調(diào)整后的模型中更為顯著。

Fat-1^tg誘導M2巨噬細胞極化，ChemR23與M2巨噬細胞標志物相關

因巨噬細胞代表狹窄瓣膜中的主要免疫細胞群，而且巨噬細胞極化是消除炎癥的關鍵步驟，對小鼠主動脈瓣膜中的不同巨噬細胞標記物進行免疫組化。雖然含有 CD68 的小葉面積比例在各組之間無顯著差異（圖 7B），但在 Fat-1^tg Apoe^-/-小鼠中觀察到 M2 巨噬細胞標志物 CD206 和精氨酸酶-1 的比例顯著增加（圖7C-D），且在ChemR23^-/-的小鼠中丟失（圖 7D）。

與小鼠瓣膜的研究結(jié)果一致，人主動脈瓣膜鈣化和非鈣化部分的ChemR23和CD206 mRNA水平之間存在強相關性，且ChemR23與M2巨噬細胞標志物CD163, CD209, CD200R1和血紅素加氧酶1呈正相關。

ChemR23^-/-導致主動脈瓣線損傷后主動脈瓣Vmax 升高和增厚增加

在高膽固醇血癥的情況下，n-3 PUFAs通過ChemR23降低主動脈瓣阻塞、厚度和鈣化，因此，使用血脂正常的 ChemR23^+/+（C57BL/6J） 和 ChemR23^-/-小鼠，并應用輕度損傷的主動脈瓣線損傷方案，建立第二個主動脈瓣疾�。ˋVD）模型。與Apoe^-/-小鼠的結(jié)果一致，與 ChemR23^+/+小鼠相比，ChemR23^-/-小鼠在主動脈瓣損傷16 周后Vmax顯著升高，組織形態(tài)分析顯示，與ChemR23^+/+小鼠相比，ChemR23^-/-小鼠的主動脈瓣葉厚度顯著增加。

小結(jié)

本研究首次揭示人主動脈瓣n-3 PUFAs含量的增加與更少的鈣化和特定的轉(zhuǎn)錄模式相關，主動脈瓣n-3 PUFAs降低體內(nèi)AVD，這在血流動力學、形態(tài)學標準及不同的小鼠模型中都一致。進一步破譯了n-3 PUFA 衍生的 RvE1 及其受體 ChemR23 成為抑制 AVD 進展的關鍵軸，本研究的結(jié)果將 n-3 PUFA/RvE1/ChemR23 軸作為一種新的潛在治療方案進行臨床評估，以減緩 AVD 進展和改善AVD患者預后。

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參考文獻

Gonzalo Artiach, Peter Sjovall, et al. Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids Decrease Aortic Valve Disease Through the Resolvin E1 and ChemR23 Axis. Circulation. 2020;142:776–789. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.041868.

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