細(xì)胞計(jì)數(shù)杯的結(jié)構(gòu)形態(tài)、使用原理與應(yīng)用前景

細(xì)胞計(jì)數(shù)杯是針對(duì)傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法存在的問(wèn)題設(shè)計(jì)的。細(xì)胞計(jì)數(shù)的正確含義是檢測(cè)細(xì)胞樣本的細(xì)胞密度，即單位體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，不是單純計(jì)量細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞密度由檢測(cè)樣本中細(xì)胞數(shù)和樣本體積兩個(gè)因素構(gòu)成，兩者都準(zhǔn)確細(xì)胞密度才準(zhǔn)確。目前有代表性的三類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀都沒(méi)有解決好細(xì)胞密度的問(wèn)題。1.傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板的問(wèn)題是計(jì)數(shù)的細(xì)胞樣本體積不準(zhǔn)確。細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池體積標(biāo)定為1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1微升，深度不包括計(jì)數(shù)池與蓋玻片之間的空隙，空隙大小不確定。實(shí)際計(jì)數(shù)樣本是充滿計(jì)數(shù)池與蓋玻片之間的空間，所以計(jì)數(shù)體積不準(zhǔn)。2.細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，如Cellometer自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。它是假定計(jì)數(shù)的顯微鏡視野相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板一個(gè)計(jì)數(shù)池的面積，沒(méi)有考慮液體深度，而且顯微鏡放大或縮小視野面積會(huì)改變，所以計(jì)數(shù)樣本體積更不準(zhǔn)確。3.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例，是根據(jù)庫(kù)爾特原理，以顆粒大小相當(dāng)于細(xì)胞大小為判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)細(xì)胞，非細(xì)胞顆粒會(huì)當(dāng)成細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞在生長(zhǎng)分裂過(guò)程中體積會(huì)有變化，過(guò)大與過(guò)小的細(xì)胞會(huì)漏計(jì)數(shù)，不同類型細(xì)胞體積可以一樣大，所以細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。這三類細(xì)胞計(jì)數(shù)器還存在一個(gè)共同問(wèn)題：計(jì)數(shù)的細(xì)胞樣品不可以回收使用。這個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)方法解決了傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法存在的問(wèn)題。這個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)杯還沒(méi)有商品，希望有興趣有能力的廠家生產(chǎn)出來(lái)，推廣應(yīng)用。

1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)杯的結(jié)構(gòu)形態(tài)
細(xì)胞計(jì)數(shù)杯是一個(gè)方形塑料杯，杯底內(nèi)表面積（不含壁厚）4.0mm×4.0mm，杯口面積6.0mm×6.0mm，杯高10.0mm，體積160微升，圖-2。杯底表面用橫豎16×16條線分割成256個(gè)方格，標(biāo)有縱橫序列號(hào)，雙線將方格分成16個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，虛線是邊線，可以劃線或不劃線，圖-1。4個(gè)計(jì)數(shù)杯一組連在一起，圖-3。連體計(jì)數(shù)杯排列在鑄有配套方孔的杯架上，隨意取放，圖-4。一個(gè)整體透明杯蓋蓋在連體計(jì)數(shù)杯與杯架上，圖-5。圖-5是實(shí)際應(yīng)用形式，置于顯微鏡上計(jì)數(shù)細(xì)胞。整套杯具無(wú)菌處理，一次性使用。計(jì)數(shù)杯架4行8列，也可以做成4行4列。質(zhì)量要點(diǎn)：（1）杯底和杯蓋一定要完全透明，（2）杯底要平整，四周不能隆起或凹下，（3）杯底劃線要均勻，方格不能有大有小。
 
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)杯的使用方法  
2.1. 基本使用方法
取10→100微升（任意選定）計(jì)數(shù)樣品，輕輕放入計(jì)數(shù)杯中，將計(jì)數(shù)杯置于倒置顯微鏡平臺(tái)上，待細(xì)胞完全沉入杯底后，按方格順序計(jì)數(shù)細(xì)胞。每個(gè)方格里的細(xì)胞數(shù)不能密度太大，1~10較好。令記錄到的總細(xì)胞數(shù)為C，樣本體積為v，稀釋倍數(shù)為f



 2.2. 快速統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)數(shù)方法

計(jì)數(shù)256個(gè)方格內(nèi)的細(xì)胞，需要5~10分鐘時(shí)間，細(xì)胞密度大需要更長(zhǎng)時(shí)間。在兩種情況下可以選擇用快速統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)數(shù)。平均每個(gè)方格里的細(xì)胞數(shù)稱為細(xì)胞均數(shù)，用μ表示，（1）μ大于8個(gè),（2）μ小于3個(gè)。例如（1）的情況，μ=10，把2560個(gè)細(xì)胞放入計(jì)數(shù)杯里，平均每個(gè)格子里10個(gè)細(xì)胞，但不會(huì)每個(gè)格子里都是10個(gè)細(xì)胞，有的多于10個(gè)，有的少于10個(gè)，大多數(shù)接近于10個(gè)，屬于正態(tài)分布。（2）的情況，μ=1，把256個(gè)細(xì)胞放入計(jì)數(shù)杯里，平均每個(gè)格子里1個(gè)細(xì)胞，但不會(huì)每個(gè)格子里都是1個(gè)細(xì)胞，有的0個(gè)，有的1個(gè)，或2個(gè)，或3個(gè)...，接近于0個(gè)和1個(gè)的較多，屬于偏態(tài)分布。圖1畫出了μ小于8的幾種情況。圖1表明，μ大于5趨近于正態(tài)分布，μ大于8屬于正態(tài)分布。

2.2.1正態(tài)分布情況計(jì)數(shù)方法
細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，如果每個(gè)方格里的細(xì)胞數(shù)多于10個(gè)，可以按正態(tài)分布計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。隨機(jī)在16個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)里選擇n（5095%）。

細(xì)胞密度=μ×256×1/v×f

2.2.2偏態(tài)分布情況計(jì)數(shù)方法
細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，如果每個(gè)方格里的細(xì)胞數(shù)少于3個(gè)，可以按偏態(tài)分布計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。Poisson分布函數(shù)適合處理概率很低（P<<1）和樣品個(gè)數(shù)很多n>>30的低頻率偏態(tài)分布事件。Poisson分布函數(shù)如下式，
 
公式(1)里的符號(hào)用細(xì)胞計(jì)數(shù)術(shù)語(yǔ)表示，
x是每個(gè)方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，x= 0, 1, 2, 3 … 20
P_(x)是一個(gè)方格內(nèi)有x陽(yáng)性細(xì)胞的概率。
e為自然對(duì)數(shù)的底e = 2.71828.
μ為平均一個(gè)方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)， μ稱為單位均數(shù)。

細(xì)胞計(jì)數(shù)，一個(gè)方格為一計(jì)數(shù)單位，計(jì)數(shù)的方格數(shù)為單位數(shù)，用n表示。用r_x表示一個(gè)方格內(nèi)有x細(xì)胞的方格數(shù)，方格內(nèi)有x細(xì)胞的概率為
 
方格內(nèi)有0細(xì)胞的概率為
 
偏態(tài)分布r_x決定于μ值。μ一定，r₀，r₁，r₂ ..., 與 P₍₀₎， P₍₁₎， P₍₂₎ ..., 就一定。反過(guò)來(lái)r_x和P_(X)一定，μ也就一定。選擇用P₍₀₎或P_(1)或P₍₂₎..., 來(lái)確定μ是一樣的。用公式(1)計(jì)算的是P_(X)理論值，用公式(2)計(jì)算的P_(X)是實(shí)驗(yàn)值，兩者等價(jià)。用公式(1)計(jì)算P_(X)時(shí)，由于涉及到指數(shù)和排列組合運(yùn)算，相當(dāng)麻煩。如果選擇x=0，P_(X)=P₍₀₎，求解μ就非常簡(jiǎn)單，
P₍₀₎為陰性單位概率，將x = 0, 代入(1) 式           
                                            
兩邊取自然對(duì)數(shù)，lnP₍₀₎ = -μ. (1) 式與(2)式等價(jià)，于是
 
(5)式表示：單位均數(shù)等于陰性單位概率的負(fù)對(duì)數(shù)。這表示只要有了P₍₀₎由(5)式即可求出單位均數(shù)μ.有了n和r₀，就有了P₍₀₎和μ. 256×μ是總細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞密度=μ×256×1/v×f

這樣，計(jì)數(shù)細(xì)胞變成了計(jì)數(shù)空格，計(jì)數(shù)空格比計(jì)數(shù)細(xì)胞容易的多。例如μ=1,大約256個(gè)格中有256個(gè)細(xì)胞，由（5）式可以計(jì)算出空格r₀=94。計(jì)數(shù)256個(gè)細(xì)胞至少需要5分鐘，計(jì)數(shù)94個(gè)空格有1分鐘就夠了。

2.3.細(xì)胞計(jì)數(shù)杯是驗(yàn)證傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法可信度的實(shí)用工具
細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)方法有兩大優(yōu)勢(shì)，（1）計(jì)數(shù)細(xì)胞量大，一般在500以上，大到3000，（2）計(jì)數(shù)細(xì)胞樣本體積大，10~100微升是傳統(tǒng)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)樣本體積0.1微升的100~1000倍。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量越多，體積越大，計(jì)數(shù)越準(zhǔn)確，所以細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞密度準(zhǔn)確度很高，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證達(dá)到98%以上，其他細(xì)胞計(jì)數(shù)方法都達(dá)不到。因此可以用作細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性比較的參照標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確度。驗(yàn)證方法就是用同一個(gè)細(xì)胞樣本，用不同方法計(jì)數(shù)，然后比較結(jié)果

2.4細(xì)胞計(jì)數(shù)杯是驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差理論的實(shí)用工具
統(tǒng)計(jì)學(xué)是一門應(yīng)用非常廣泛的學(xué)科。誤差分析理論是其應(yīng)用基礎(chǔ)，誤差公式是用數(shù)學(xué)理論推導(dǎo)出來(lái)的，老師講授，學(xué)生接受，很少有人用實(shí)驗(yàn)做驗(yàn)證，不是沒(méi)有人想驗(yàn)證，主要是沒(méi)有簡(jiǎn)單實(shí)用的驗(yàn)證工具和方法。一般實(shí)驗(yàn)方法，因?yàn)闊o(wú)法獲得標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)值而無(wú)法驗(yàn)證。有了細(xì)胞計(jì)數(shù)杯，這個(gè)問(wèn)題就解決了。統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差分析理論有兩套系統(tǒng)：正態(tài)分布系統(tǒng)和偏態(tài)分布系統(tǒng)。

2.4.1正態(tài)分布誤差分析公式
（1）樣本抽樣誤差
標(biāo)準(zhǔn)差是表示一套變量離散程度的指標(biāo)，均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)合起來(lái)說(shuō)明變量的分布情況�？傮w標(biāo)準(zhǔn)差公式, 
 
式中σ-總體標(biāo)準(zhǔn)差，x-變量值, μ-總體均數(shù)，N-變量個(gè)數(shù)。
由于很難獲得μ值，一般用樣本標(biāo)準(zhǔn)差估計(jì)總體標(biāo)準(zhǔn)差。
樣本標(biāo)準(zhǔn)差公式：
 
式中S-樣本標(biāo)準(zhǔn)差，-樣本均數(shù), n-變量個(gè)數(shù)。(7)式運(yùn)算比較麻煩,一般轉(zhuǎn)換成下式計(jì)算，
 
（2）均數(shù)抽樣誤差
從同一個(gè)總體中隨機(jī)抽取同樣大小的樣本，由于存在抽樣誤差，各樣本均數(shù)不會(huì)相同。以樣本均數(shù)做變量值計(jì)算樣本均數(shù)變異情況的標(biāo)準(zhǔn)差，稱為均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤。統(tǒng)計(jì)學(xué)理論表明，均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤（）與總體標(biāo)準(zhǔn)差（σ_x）及樣本大�。╪）的關(guān)系如下，
 
實(shí)際上總體標(biāo)準(zhǔn)差（σ）很難得到，只能獲得樣本誤差（S），一般用樣本誤差代替總體標(biāo)準(zhǔn)差（σ）求得均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤的估計(jì)值,
 
2.4.2偏態(tài)分布誤差分析公式
處理偏態(tài)分布事件的公式主要有二項(xiàng)式分布和Poisson分布。以Poisson分布為例，Poisson分布如（1）式，其均數(shù)誤差公式為，
 
樣本均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤估計(jì)值為
 
2.4.3均數(shù)的可信限
從均數(shù)為μ，方差為σ²的正態(tài)分布總體中隨機(jī)抽取n樣本，則樣本均數(shù)近似以總體均數(shù)為中心的正態(tài)分布。根據(jù)正態(tài)分布理論，樣本均數(shù)（）與總體均數(shù)（μ）有如下關(guān)系
 
2.5如何用細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證正態(tài)分布誤差理論的正確性
2.5.1驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的隨機(jī)事件是否符合正態(tài)分布或偏態(tài)分布狀態(tài)
方法是將細(xì)胞計(jì)數(shù)杯放置水平，輕輕放入細(xì)胞，使之慢慢沉降，隨機(jī)分布在杯底。然后計(jì)數(shù)方格中的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)相同的歸為一組，稱為頻數(shù)，最后按頻數(shù)大小排序，畫在二維坐標(biāo)圖上。根據(jù)頻數(shù)排序和頻數(shù)圖，確定均數(shù)大于10的符不符合正態(tài)分布理論，均數(shù)小于3的符不符合偏態(tài)分布理論。

2.5.2驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)抽樣誤差理論的方法
舉一個(gè)例子，調(diào)查中國(guó)家庭收入平均水平。不可能對(duì)全部家庭都做調(diào)查，可以在全國(guó)各省區(qū)隨機(jī)分別抽取300戶家庭，合計(jì)有10000個(gè)家庭。一個(gè)辦法是收集每個(gè)家庭的收入，計(jì)算家庭收入平均值和離散狀況（樣本誤差）。另一個(gè)辦法是將10000個(gè)家庭隨機(jī)分成100個(gè)或200個(gè)樣本，計(jì)算樣本均數(shù)，然后求解均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果得到一個(gè)樣本均數(shù)（，μ）和標(biāo)準(zhǔn)差（S,S_μ）和均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤估計(jì)值（）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果對(duì)不對(duì)？符不符合真實(shí)情況？可信度多大？本例因?yàn)槟貌坏娇傮w均數(shù)μ值，沒(méi)有參照標(biāo)準(zhǔn)作，說(shuō)不清楚。只能認(rèn)為理論公式正確，結(jié)果就正確。公式正不正確?需要實(shí)踐證明，至今未見(jiàn)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明。細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)方法，因?yàn)槟軌虬延?jì)數(shù)杯里的細(xì)胞全部準(zhǔn)確計(jì)數(shù)出來(lái)，可以拿到總體均數(shù)μ值，所以能夠驗(yàn)證誤差公式的正確性。方法是，先按2.4.1方法將每個(gè)方格中的細(xì)胞計(jì)數(shù)出來(lái)，計(jì)算總體均數(shù)μ值，然后用誤差公式計(jì)算誤差值，誤差大小與樣本數(shù)（n）有關(guān)系，應(yīng)該計(jì)算不同樣本數(shù)的誤差值。最后將結(jié)果帶入公式 (15)，公式成立證明正確，否則不正確，進(jìn)而確定什么情況下正確，什么情況下不正確。

驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)學(xué)理論目的不只是證誤，而是提供一個(gè)實(shí)證和感性認(rèn)識(shí)，讓學(xué)習(xí)者從理論和實(shí)踐兩方面認(rèn)識(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，加深對(duì)理論的理解，應(yīng)用起來(lái)心里踏實(shí)。

3.細(xì)胞計(jì)數(shù)杯的應(yīng)用前景
上述情況表明，細(xì)胞計(jì)數(shù)杯計(jì)數(shù)方法避免了傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法存在的問(wèn)題，大大提高了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，對(duì)于細(xì)胞學(xué)研究和臨床應(yīng)用具有重要意義，其計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性和多用途優(yōu)勢(shì)使其具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論的驗(yàn)證功能，開(kāi)設(shè)統(tǒng)計(jì)學(xué)課程的大、中、專院校都需要這樣的工具和方法。