光纖記錄技術深度解析，揭開拓展實驗研究的奧秘
光纖記錄（Fiber photometry）通過時間相關單光子計數(shù)(TCSPC)的光纖光學來測量熒光分子在大腦中發(fā)出的光信號。基于基本原理，使用直徑較小的光纖探頭就能實現(xiàn)傳輸并收集熒光信號，將采集到的發(fā)射信號通過二色鏡進行光譜分離，并通過濾波器聚焦到探測器上，即可檢測出熒光的實時動態(tài)變化。
1. 植入的光纖探頭體積小且柔韌性好，使得周圍組織損傷較��；
2. 因為植入光纖體積小，方便同時記錄多個大腦區(qū)域的信號；
3. 基于TCSPC的光纖是檢測發(fā)射光的超靈敏工具，滿足在低強度激發(fā)光下即可檢測熒光，從而減少了光漂白的機會，并延長了記錄時間。
目前光纖記錄常用于檢測鈣信號及神經遞質信號變化，背后原理是通過給實驗動物注射基因編碼型的熒光探針/生物傳感器，隨后通過光纖記錄即可檢測到對應神經信號的變化�；蚓幋a生物傳感器是一類生物分子信號介質，它被整合到細胞的基因組中，然后由細胞的分子機制產生。這些蛋白質結構可以被設計成在化學物質存在或細胞環(huán)境變化時改變構象，從而產生熒光信號。
常見的基因編碼型的生物傳感器根據(jù)應用場景主要分為：
1、膜去極化。一旦動作電位(AP)被激活，AP將沿軸突向下傳播，并使突觸前鈕扣對應的膜去極化(從−65 mV到+40 mV或更大)。這種膜去極化作為神經元激活的分子特征，可以通過遺傳編碼的電壓指示探針(GEVIs)檢測；
2、電壓門控Ca2+通道激活和輸入。當膜去極化發(fā)生在突觸前活躍區(qū)，電壓門控Ca2+通道打開，導致Ca2+快速內流。這種升高的細胞質Ca2+濃度(從~100-~400nM)的變化可以持續(xù)約50-150毫秒，通過基因編碼Ca2+指示劑(GECIs)即可檢測；
3、膜泡融合/胞外分泌。胞質Ca2+水平升高觸發(fā)易于釋放的突觸囊泡的胞外排泄，這些突觸囊泡充滿了神經遞質。在胞外分泌過程中，當突觸囊泡與質膜融合時，細胞外介質(pH ~ 7.4)中和囊泡腔(pH ~ 5.5)的酸性pH值，這種中和作用可以通過pH值指標探針檢測，如pHluorin；
4、神經遞質傳遞。一旦神經遞質被釋放到突觸，它們的功能根據(jù)遞質類型而異，可以通過神經遞質(NT)指標檢測，如iAChSnFR和 dLight�；蚓幋a型乙酰膽堿(ACh)探針iAChSnFR用于檢測不同生物樣品中的ACh瞬變。它被設計成在膽堿結合時發(fā)出熒光，并被證實可用于測量小鼠體內獎勵活動中海馬ACh傳遞的反應。dLight是一種基于受體的遺傳編碼多巴胺(DA)熒光探針。它是通過用環(huán)狀排列的綠色熒光蛋白(cpGFP)取代DA受體(DAR)的第三個胞內環(huán)（Intracellular Loop 3，ICL3）的位置而構建的。dLight產生不同的熒光強度對應于DA與DAR的結合量。
圖1所示：光纖記錄系統(tǒng)原理和基因編碼熒光探針。
A.光纖記錄裝置和信號處理的原理圖。在該模型中，將基因編碼的熒光探針病毒注射到腹側被蓋區(qū)(VTA)，投射的信號從伏隔核(NAc)和前額皮質(PFC)記錄下來。
B.四種不同的基因編碼型探針及其對應的神經傳遞分子信號的示意圖表示。隨著動作電位(AP)的傳播，電壓門控鈣(Ca2+)通道被觸發(fā)打開，導致快速的Ca2+內流；隨即誘導突觸囊泡的胞吐，突觸囊泡將神經遞質(NTs)釋放到突觸間隙，在突觸間隙中神經遞質可以與相應的受體結合并激活突觸后神經元，這些分子特征可以通過電壓指標(GEVIs) ，Ca2+探針(GECIs)， pH值指標探針(如pHluorin)，NT指標探針(G protein-coupled受體,GCPR)進行檢測。示意圖非真實比例。
光纖記錄實驗操作較為簡便，目前在神經環(huán)路分子機制探究上應用越發(fā)廣泛，同時越來越多的實驗室將光纖記錄與其他實驗技術進行聯(lián)合應用。
1、光纖記錄與光遺傳
光遺傳學是一種以光作為工具特異性激活或抑制神經傳遞的方法。研究人員經常使用光遺傳學以極大的時間精確度來研究確定的神經元亞群對特定行為的影響。但是光照的作用僅僅通過動物行為的檢測評估是不完善的，很有可能存在“假陽性”和“假陰性”，且不能排除自然行為的干擾。而光纖記錄即可提供足夠的證據(jù)支撐。光遺傳學結合光纖記錄的方法使研究人員能夠研究特定細胞、它們的投射關系的功能意義。
2、光纖記錄與核磁
一般認為，血氧水平檢測(BOLD) fMRI(功能性磁共振成像)通過血管耦合機制與神經傳遞在時空上相關。為了更深入地了解神經元對BOLD信號的貢獻，電生理學技術已被納入功能磁共振成像研究。雖然這些研究提供了關于神經元環(huán)路更具體的信息，但功能磁共振成像(fMRI)所需要的磁場會在電生理信號中產生偽影。
而近幾年的研究中將光纖記錄和fMRI相結合，證明了Ca2+峰值和不同大腦區(qū)域的BOLD信號之間的聯(lián)系，同時有文獻證明星形膠質細胞Ca2+水平的變化與BOLD信號也有關聯(lián)。fMRI技術與光纖記錄相結合，使fMRI掃描具有細胞分辨率。這種綜合技術有潛力闡明單個神經元亞群對大腦回路的貢獻。
圖2所示：將BOLD fMRI技術與細胞-特異性病毒傳遞的GCaMP6（一種遺傳編碼的鈣指示劑，GECI）的光學檢測技術相結合（Schlegel et al .,Nature protocols(2018)）
3、光纖記錄與電生理
目前，電生理學是研究行為與自由行為動物體內神經元動力學關系的金標準分析技術。電生理學允許同時記錄數(shù)百或數(shù)千個細胞、離子通道和神經元活動，電極可以落在單個細胞上，記錄細胞內信號變化，或者落在細胞外空間，監(jiān)測整個大腦區(qū)域的電生理信號。它測量的電信號（電流或電位）以高時間分辨率的毫秒級離子通量導出。
電極陣列記錄來自電極尖端附近所有細胞的信號，不能直接區(qū)分細胞種類。由于光纖記錄方法缺乏較高的時間分辨率，在體電生理學缺乏細胞類型特異性，二者結合有助于高時空分辨率下研究不同的大腦區(qū)域特定環(huán)路和行為狀態(tài)。
R820三色光纖記錄系統(tǒng)，可記錄GCaMP、dLight等綠色熒光指示劑或遞質探針，及RCaMP、jrGECO1a等紅色指示劑或遞質探針信號，同時特有的410nm光源用于獲取對照信號，有效排除噪聲。靈活的TTL信號輸入輸出設置，更方便拓展實驗應用。
