小鼠眼球注射實驗操作和方法與技巧

背景：

目前在全球范圍內(nèi)因為眼部疾病致盲人數(shù)約有4000萬，這其中有相當(dāng)一部分屬于遺傳性視神經(jīng)病變，如老年黃斑變性、Leber先天性黑朦、Leber遺傳視神經(jīng)病變等等^[1]。

隨著基因療法的興起，通過腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒(LV)等作為藥物遞送載體，對遺傳性眼部疾病進行基因修正已經(jīng)取得許多重大進展，越來越多的基因藥物被開發(fā)出來，而小鼠作為常用的藥物篩選模型，在基因治療的臨床前研究中占據(jù)重要地位。

眼球作為相對獨立的器官，球內(nèi)注射是最有效的藥物遞送方式。眼球注射可突破血眼屏障,使藥物迅速濃集于眼內(nèi), 繼而在眼內(nèi)擴散到達作用部位。具有代表性的眼內(nèi)注射給藥途徑有視網(wǎng)膜下(subretinal)注射和玻璃體腔(Intravitreal)注射，玻璃體內(nèi)注射能夠使基因藥物可以較快擴散至視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜部位，如臨床上常用于老年性黃斑變性的藥物輸送；視網(wǎng)膜下注射可將藥物直接傳遞到視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)之間的潛在空間，是將藥物直接遞送至RPE細(xì)胞的最佳方法。
 

玻璃體注射和視網(wǎng)膜下注射示意圖^[2]

一、視網(wǎng)膜下注射

實驗儀器耗材：
手術(shù)器械、吸入式麻醉機、Hamilton注射器（30G、33G）、托品酰胺、去氧腎上腺素、手術(shù)顯微鏡

實驗步驟：
1. 動物麻醉
1) 小鼠置于誘導(dǎo)盒內(nèi)進行吸入式異氟烷麻醉，捏合小鼠腳指確認(rèn)是否麻醉完全
2) 將老鼠轉(zhuǎn)移到解剖顯微鏡下，連接鼻錐持續(xù)給予異氟烷
3) 待注射眼睛滴加一滴丙美卡因(或類似的表面麻醉劑)防止注射引起局部反射，輕觸結(jié)膜確定麻醉深度。

2. 擴瞳
1) 傾斜鼠標(biāo)頭部，使待注射眼睛在視野范圍內(nèi)，用棉簽擦去任何多余的液體
2) 向待注射眼球滴加1-2滴1%托品酰胺和0.5%去氧腎上腺素用于擴大瞳孔

3. 鞏膜切口
1) 使用鑷子在上下眼瞼之間滑動，使眼球從眼窩中伸出，暴露鞏膜
2) 采用30G針頭在角鞏膜緣后面做一個小的鞏膜預(yù)切口，如果液體從切口處流出，則針頭穿刺過深而進入玻璃體腔，之后注射過程中的液體可能進入玻璃體腔
 

角鞏膜緣稍后處切口示意圖
 

4. 注射
1) 用鑷子輕輕捏緊緣下約1mm處的結(jié)膜保持眼球固定
2) 將裝好注射液的33G注射針插入預(yù)切口，針與眼球表面相切，沿鞏膜內(nèi)表面穿過，尖端進入約1mm，穿過鞏膜和脈絡(luò)膜，到達視網(wǎng)膜下間隙
3) 操作注射器平穩(wěn)注入適量液體，注意注射過程避免晃動引起額外的組織損傷
4) 注射后，停留針頭約30秒，以防漏液，然后將針頭慢慢抽出
5) 取出鑷子，重新放置結(jié)膜，輕輕將眼睛放回眼窩，閉上眼瞼
6) 如果需要雙側(cè)眼球注射，將另一面眼球轉(zhuǎn)到顯微鏡視野下重復(fù)上述步驟
 

視網(wǎng)膜下注射進針示意圖^[3]
 

R480玻璃電極注射泵搭配顯微操縱器可滿足大小鼠眼球精準(zhǔn)注射實驗，采用更細(xì)的玻璃毛細(xì)管代替常規(guī)33g注射針頭保證更小的注射損傷

5. 恢復(fù)
1) 可在角膜和注射區(qū)域涂抹抗生素眼藥膏防止感染
2) 將動物放在加熱墊上使其完全恢復(fù)(2-3分鐘)，然后將其轉(zhuǎn)移回籠子繼續(xù)飼養(yǎng)
 

二、玻璃體內(nèi)注射

玻璃體內(nèi)注射與視網(wǎng)膜下注射類似，在用鑷子保持眼球穩(wěn)定的同時，將裝好藥物的針頭，相對視神經(jīng)約60度角，從角鞏膜緣(Limbus)后預(yù)切口，插入約1mm進行玻璃體腔注射。需要注意晶狀體占據(jù)玻璃體腔的大部分，應(yīng)小心避免刺穿晶狀體。

玻璃體腔注射進針示意圖^[4]

注意事項：
1）眼球注射過程應(yīng)確保動物眼睛一直濕潤，避免角膜干燥，可根據(jù)需要多次使用潤滑滴眼液。
2）注射過程應(yīng)緩慢進行，避免速度過快造成液體從注射部位回流
3）眼球注射前應(yīng)充分?jǐn)U瞳，瞳孔過小不易看清眼底，會降低注射成功率，同時瞳孔過小也是虹膜出血的主要原因
4）角膜穿刺點靠近角鞏緣處為好，以免形成角膜白斑而影響后續(xù)動物實驗
5）視網(wǎng)膜下注射，注射針插入切口部位，應(yīng)平行于眼外壁推進，保證準(zhǔn)確進入視網(wǎng)膜下空間，如果太靠近外壁或太深，將會導(dǎo)致注射針進入錯誤位置。

【參考文獻】

1.Bourne R, et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment:a syste-matic review and meta-analysis.Lancet Glob Health.2017;5:e888–e897

2.Katherine JW,et al.Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.J Vis Exp.2012;(69):4286

3.Bennett J,et al.Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after rAAV-mediated retinal transduction.Methods Enzymol.2000;316:777–789.

4.Cameron EG,et al.Optic Nerve Crush in Mice to Study Retinal Ganglion Cell Survival and Regeneration. Bio Protoc.2020;10(6):e3559