線蟲顯微注射超詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟操作教程

秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)是研究動(dòng)物遺傳、個(gè)體發(fā)育和行為活動(dòng)的重要模式生物，能夠研究從分子細(xì)胞水平到整體系統(tǒng)水平的相關(guān)生命活動(dòng)的作用機(jī)理。顯微注射技術(shù)使用尖端開口直徑為微米級(jí)的玻璃微管，將核酸注入線蟲的性腺，進(jìn)而被成熟的卵細(xì)胞吸收，以染色體外遺傳物質(zhì)的形式存在。而顯微注射技術(shù)是線蟲領(lǐng)域的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于研究線蟲的基因表達(dá)、功能和基因間的相互作用等。
 

（圖片來源于攝影師馬克奧-西奧卡）

實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

主要儀器包括：

顯微操縱器、拉制儀、注射泵、體式顯微鏡或倒置顯微鏡等。

試劑耗材包括：

瓊脂糖、礦物油、帶芯玻璃管、載玻片、拾取針、恢復(fù)緩沖液、OP50培養(yǎng)基、加樣針等。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

01、制備瓊脂糖固定板

移液槍取約50μl加熱溶解的2%瓊脂糖溶液滴在24mm×60 mm的載玻片上，用另一載玻片輕壓其上(小心氣泡產(chǎn)生)，待瓊脂糖凝固后(約5分鐘)，將上面的玻片從側(cè)面滑下即可。將制作好的瓊脂板室溫過夜或80℃干燥1小時(shí)后可疊放起來備用。
 

圖：瓊脂糖固定板的制備^[1]。A. 用兩條膠帶將載玻片固定在干凈的工作臺(tái)上；B. 在載玻片中間滴一滴約50μl新鮮熱熔2% 瓊脂糖溶液；C. 將顯微鏡載玻片放在瓊脂糖滴上，輕輕按下使其變平。瓊脂糖凝固并取出顯微鏡載玻片。
 

02、制備注射針

注射針對于注射成功與否至關(guān)重要，使用水平拉制儀通過調(diào)節(jié)速度、拉力等參數(shù)可穩(wěn)定獲得兩根相同的注射針，建議使用有芯玻璃管進(jìn)行拉制，其芯能夠使注射液迅速充滿針頭尖端，可以很好的排出氣泡。注射針的錐度一般5-7mm，尖端0.5-0.9μm。

MP-500有著前衛(wèi)智能的操作界面及加熱片限位槽等人性化設(shè)計(jì)，集安全性與人性化于一體，輕松滿足微電極相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需求。
 

 

03、制備注射液并加入注射針

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇擬注射的物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等。注射物的純度是轉(zhuǎn)入效率高低的重要影響因素之一。通過注射針的尾端，用細(xì)長的加樣針將注射液灌入，等待數(shù)分鐘，觀察針尖有無氣泡。

04、注射體積校準(zhǔn)

將注射針裝到注射泵上，吸入待注射液。在顯微鏡視野中心放一把微尺，上面放置一個(gè)裝適量礦物油的4厘米的培養(yǎng)皿。將注射針浸入礦物油中，注射一次得到一個(gè)液滴球，通過微尺測量球體直徑計(jì)算出注射的體積，調(diào)整注射液滴的大小使其符合所需的直徑。1 nL液滴的半徑為0.062 mm (V = 4/3πR3)。

瑞沃德R480玻璃微電極注射泵，注射精度高，運(yùn)行穩(wěn)定，密封性良好，保證注射過程不會(huì)出現(xiàn)漏液情況。

 

05、破針

將玻片放在加入注射油的瓊脂墊上，移動(dòng)微操使注射針與玻片邊緣相撞，注射針尖端被撞破，可觀察到有液泡自動(dòng)滲出，該方法更易于刺入線蟲體內(nèi)。

06、固定線蟲

一般挑選即將產(chǎn)卵或體內(nèi)有少量卵的年輕成蟲進(jìn)行注射，此時(shí)期性腺發(fā)育成熟，較易被DNA 轉(zhuǎn)染從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。使用拾取針將線蟲挑至瓊脂糖固定墊上，調(diào)整位置使性腺暴露，滴加注射油覆蓋整個(gè)蟲體。固定操作要迅速，否則線蟲容易脫水而死。
 

圖：固定在固定板上并準(zhǔn)備注射的線蟲。箭頭表示在性腺中注射首選部位。比例尺為50μm^[1]。

07、注射

將瓊脂糖固定板放在載物臺(tái)上，顯微鏡下找到線蟲，調(diào)整焦距，將性腺部位聚焦在正確的平面。使用微操，將注射針尖刺入性腺。啟動(dòng)微量注射泵進(jìn)行注射，能觀察到注射液在性腺中快速流動(dòng)，注射后的性腺被液體充滿。
 

圖：顯示注射物注射前(1)和注射后(2)的流動(dòng)。箭頭標(biāo)記性腺中的區(qū)域，注射物到達(dá)的位置^[2]。

MM-500電動(dòng)顯微操縱器與顯微鏡配合使用，可以完成人手不能從事的精細(xì)運(yùn)動(dòng)的顯微操作，體積小巧輕便，人性化中英文操作界面，操作起來更便捷。
 

 

08、恢復(fù)

在體視顯微鏡下，滴加恢復(fù)緩沖液至注射后的線蟲。一般等待2-5 min，線蟲活力恢復(fù)，即頭部左右搖擺，身體開始游動(dòng)，即可挑至培養(yǎng)板上，進(jìn)行20℃常規(guī)培養(yǎng)。

瑞沃德提供MP-500程控水平電極拉制儀、MM-500電動(dòng)顯微操縱器、R480玻璃微電極注射泵組合方案，可對斑馬魚、線蟲等胚胎、幼體進(jìn)行超精細(xì)顯微注射。
 

瑞沃德注射系統(tǒng)

注意事項(xiàng)^[2]：

a．瓊脂糖固定板：若線蟲在瓊脂糖固定板上短時(shí)間內(nèi)死亡，則說明固定板過于干燥，可換瓊脂糖層稍薄的固定墊，因?yàn)榄傊�糖的主要作用是吸收線蟲的水分；若線蟲無法粘牢，則說明固定墊太濕或太薄，可繼續(xù)在烘箱內(nèi)放一段時(shí)間，或?qū)⒕�蟲先粘在固定墊上后加油；

b．注射物質(zhì)：注射DNA使用前要混勻并離心以避免雜質(zhì)阻塞針頭。注射DNA的總濃度一般控制在200mg/L以下，因?yàn)檩^高濃度的DNA可能產(chǎn)生毒性或過量表達(dá)，從而影響下一代的表型恢復(fù)；

c．注射角度：注射針與性腺最好呈銳角，推薦與頭部或尾部幾乎平行或呈15℃角；

d．實(shí)驗(yàn)樣本：被注射的線蟲需要保證其食物充足，生長狀態(tài)健康；

f．注射后線蟲死亡率高：注射后等待恢復(fù)的時(shí)間過短或太長；可能是注射針尖太粗或注射DNA 被污染。針對此原因，可使用較細(xì)注射針，每次只注射一側(cè)性腺，若注射操作正確，但不產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因線蟲，則可能是轉(zhuǎn)基因致死或注射核酸污染，可重新純化。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Matthias Rieckher and Nektarios Tavernarakis. Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.