活細胞成像的挑戰(zhàn)與常見問題

了解復(fù)雜且快速變化的細胞動力學(xué)是深入探索生物進程的重要一步。因此，現(xiàn)代生命科學(xué)研究越來越需要關(guān)注于在分子水平上實時發(fā)生的生理事件。
 
 
觀察和分析活細胞時面臨的挑戰(zhàn)
在固定細胞或組織中，獲取樣品“分子狀態(tài)”的信息已是一項艱巨的任務(wù)。如果需要獲取實時信息，，就必須盡可能在實驗過程中保證細胞自然地運行生理機制，因此將加大實驗的困難程度。此外，由于很多生理過程的持續(xù)時間僅有幾秒甚至幾毫秒（例如細胞內(nèi)離子水平的變化），必須在相對較短的時間內(nèi)采集大量信息。
滿足這些挑戰(zhàn)性需求的一種方法是采用被統(tǒng)稱為活細胞成像的光學(xué)技術(shù)�；罴毎�成像可研究活細胞中的實時動態(tài)生理過程，而非提供細胞當前狀態(tài)的一幅“快照”。它把快照轉(zhuǎn)變成了電影�；罴毎�成像可提供單個細胞、細胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)（原位）甚至整個生物體（體內(nèi)）中動態(tài)發(fā)生分子事件的空間和時間信息。這些特性讓活細胞成像成為了研究細胞生物學(xué)、癌癥、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)中動態(tài)生理過程的必要技術(shù)。
近年來，電子學(xué)、光學(xué)和生物化學(xué)的迅速發(fā)展，使得科學(xué)家們更輕松的實現(xiàn)活細胞成像。如今的活細胞成像方法使用優(yōu)化的顯微鏡、專用光源、高速相機、高靈敏度探測器和特異性的熒光標記物，可同時提供技術(shù)成熟且仍具有創(chuàng)新性的全套解決方案，滿足在分子水平上對單細胞或整個細胞網(wǎng)絡(luò)進行實時研究的挑戰(zhàn)性需求。
使用線粒體標記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細胞進行活細胞成像
 
圖1：熒光鈣染料Fluo-4標記的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。鈣染料的位置類似于表征細胞內(nèi)的鈣分布。
 
圖2：線粒體標記物MitoRed®染色的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。
 
圖3：圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體的共定位情況。
 
圖4：睪丸支持細胞的DIC圖像。
 
使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞琛工業(yè)大學(xué)生物II研究所化學(xué)感知系Sophie Veitinger博士提供。（地址：德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)細胞生物學(xué)和細胞病理學(xué)研究所）
對應(yīng)刊物（非圖片來源）：
 
活細胞成像中的常見問題
活細胞成像通常適用于培養(yǎng)的細胞系（例如HEK細胞、HeLa細胞）、原代細胞（例如皮膚細胞、神經(jīng)細胞）、急性制備的組織切片（例如腦切片）或整個器官或生物體。因為細胞被帶出其原本“自然”的培養(yǎng)環(huán)境并會受到光毒性的影響，所以在實驗過程中的首要任務(wù)是保持細胞的健康狀態(tài)。
 
細胞外溶液
不同類型的人工細胞外溶液（林格氏液、人工腦脊液(ACSF)）和培養(yǎng)基（例如Leibovitz L-15）用于為細胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用于活細胞成像的培養(yǎng)基成分包括從極簡單的“含鹽”溶液（例如林格氏液）到非常復(fù)雜的混合物（例如Leibovitz L-15），種類繁多。
但所有溶液都有一個共同點，即都包含pH緩沖液，因為暴露在環(huán)境中之后，會顯著改變培養(yǎng)的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多細胞外溶液中，pH緩沖液通過添加10–20 mM兩性離子有機化學(xué)品HEPES（2-[4-（2-羥乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸）來實現(xiàn)。但對于很多細胞來說，細胞外溶液不能用HEPES或其他化學(xué)緩沖液（例如MOPS、TES），因為培養(yǎng)基中缺乏pH緩沖碳酸氫鹽會對細胞造成傷害。要解決該問題，必須將二氧化碳輸送到細胞外溶液中（二氧化碳與細胞外溶液接觸時，會轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽）。這可以通過兩種方式實現(xiàn)：一種是不斷輸送氣態(tài)二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧氣和5%的二氧化碳）到細胞外溶液中，并不斷對細胞進行換液。這種方法通常用于代謝周轉(zhuǎn)率高于細胞增殖的切片制備。
另一種常見的方法是將細胞保存在可調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境氣體濃度和溫度（在很多情況下）的培養(yǎng)室中。在此類培養(yǎng)物中持續(xù)供應(yīng)5-7%的二氧化碳氣體，并且可以嚴格控制溫度。必須根據(jù)使用的樣品類型和實驗的持續(xù)時間，來確定化學(xué)緩沖的細胞外溶液是否足以使細胞保持良好狀態(tài)，或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養(yǎng)小室。在很多情況下，化學(xué)緩沖溶液即可滿足細胞培養(yǎng)和短時實驗的要求。，因為急性切片代謝周轉(zhuǎn)率要高得多，通常需要足夠的二氧化碳供應(yīng)。但對于很多細胞類型和長時間成像實驗，必須使用培養(yǎng)小室。
 
光毒性
使用熒光染料進行活細胞成像的另一個問題是：激光或高強度電弧放電燈的入射光會損害細胞，即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發(fā)時發(fā)生。熒光染料被激發(fā)后，它們將與分子氧發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生自由基。為避免光毒性，必須選擇盡可能低的光強度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時間，以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實驗設(shè)計過程中，還必須考慮實驗的持續(xù)時間。長時間實驗中，通常不需要高幀速率。因此，圖像采集的周期頻率通�？梢詮睦�如每秒10多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量，從而大幅降低光毒性。
對于低強度熒光信號成像，可以考慮更改圖像采集條件設(shè)置，比如在大多數(shù)情況下，通過將相機功能用作像素合并或提高增益，甚至使用特殊的高靈敏度相機（例如EM-CCD相機）進行成像。這樣可以在不增加激發(fā)持續(xù)時間或光強度的情況下實現(xiàn)更好的信噪比和信號質(zhì)量，而這兩者都會導(dǎo)致更高的光毒性。此外，選擇具有長激發(fā)波長的熒光基團也可降低光毒性，因為與具有短激發(fā)波長的熒光基團相比，傳遞給樣品的能量更低。熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白(GFP)）的光敏位點位于被多肽包膜覆蓋的蛋白質(zhì)內(nèi)部，因此通常沒有光毒性。
 
焦面漂移
此外，在長時間的活細胞成像實驗中，很可能發(fā)生焦面漂移的問題，，�？梢允褂门鋫溆熊浖�或硬件控制自動對焦的成像儀器來避免這種情況。
 
圖5：接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的運動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以游離蛋白的形式大量表達（因此未融合于MP或CP），并且可以定位在受感染的表皮和葉肉細胞的細胞質(zhì)和細胞核中。由荷蘭瓦赫寧根農(nóng)業(yè)大學(xué)，生物分子科學(xué)部門分子生物學(xué)實驗室的Joan Wellink博士及植物科學(xué)部門病毒學(xué)實驗室的Jan van Lent博士提供。
 
 
視頻1：用DIOC6染色的活洋蔥球細胞，同時進行透射光檢測；使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝，63倍物鏡，1.5倍變焦，2倍線平均，掃描分辨率512 x 265，速度每秒4.7幀。
 
視頻2：用表達GFP融合蛋白的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的COS細胞。細胞溶質(zhì)蛋白在細胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm，14層切)每5秒記錄一次，，持續(xù)10分鐘。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素，雙向掃描，變焦2倍，物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細胞生物學(xué)研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用于活細胞成像的方法
可應(yīng)用于活細胞成像的寬場和共聚焦顯微技術(shù)的范圍也非常廣泛。通常，使用復(fù)式顯微鏡和反差對比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC）），隨時間觀察細胞的生長、聚集或運動過程。此外，通常使用體視顯微鏡或宏觀鏡對大型標本（例如發(fā)育中的斑馬魚胚胎）進行延時成像。在過去數(shù)十年中，先進熒光技術(shù)變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應(yīng)用的迅速增加，使生物研究的視角從平面向三維立體轉(zhuǎn)變。
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活細胞成像技術(shù)——觀察生命的分子水平動態(tài)
 
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